[发明专利]缺血修饰白蛋白组合测定试剂、测定方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及医学领域，具体涉及一种缺血修饰白蛋白组合测定试剂及利用其对缺血修饰白蛋白的测定方法，以及盛装所述试剂的试剂盒 。

背景技术

缺血修饰白蛋白(Ischemia-modified albumin,简称IMA)是指在临床缺血或再灌注医疗手段发生时，由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变，这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白称为缺血修饰白蛋白。

人血清白蛋白(Human serum albumin简称HSA)是一种循环蛋白，由585个氨基酸序列(66500Da)组成，其氨基末端(N-terminus)是人类所特有的一段序列。己有研究证实HSA的氨基末端即为过渡金属钴、铜和镍等离子的结合位点。HSA上这些金属的结合点、位点与其他动物的白蛋白相比容易被生物化学因素降解而破坏。当发生缺血时，细胞内及细胞外氧供给减少、酸性代谢产物增多、细胞膜能量依赖的钠泵破坏、钙泵失控，这些因素将导致HSA氨基末端结构改变，使HSA与金属的结合能力降低。短暂缺血后发生的再灌注会产生大量的自由基，同时游离铜离子和铁离子暴露，将进一步加重HSA这种改变，这是机体“牺牲”白蛋白以对抗缺氧、避免和尽量减少组织损伤的一种机制。

美国Bar-Or D(以下简称Bar-Or D方法)等发明了IMA的快速检测方法和试剂盒。该发明的基本原理为:正常对照组的血清样品中白蛋白以活性形式存在，加入过度已知量的钴离子溶液后，钴离子即可与白蛋白结合，溶液中未结合钴离子浓度较低;而心肌缺血病人的血清样品中含有较多缺血性修饰白蛋白，加入同样浓度钴离子溶液后，由于IMA与钴离子结合的能力弱，溶液中存在较高浓度的未结合钴离子，未结合钴离子与显色剂发生颜色反应后，采用分光光度比

色仪在450-500nm处检测样品吸光度，所得数据与一已知标准IMA曲线进行对照，即可得出IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml )表示。具体测试步骤如下：在被测血清中加入过度已知量的钴离子溶液形成混合液，摇匀在18-37℃温育至少4-5分钟，反应pH7-9较佳;将二硫苏糖醇(1, 4-Dithiothreitol，简称DTT)显色剂与上述混合液摇匀反应，随后加入氯化钠溶液，采用全自动生化分析仪，在450-500nm处检测样品吸光度，所得OD值与一个已知标准的IMA动力学曲线进行对照，即可得到IMA值，其测定值用每毫升单位(U/ml)表示。

虽然IMA的检测在诊断心肌缺血方面具有明显的优势，但是目前上述已有技术的缺血性修饰白蛋白的检测方法明显存在下列的不足，严重影响了临床的进一步推广使用:

1.已有技术IMA试剂盒及检侧方法不能在中小型生化分析仪或分光光度仪上使用

目前美国Inverness公司销售的IMA检测试剂盒只能在极少数几种日立和罗士型号的全自动生化仪上使用，而这几种型号的全自动生化仪在我国医院中没有。一般来说，只要有上机参数，生化试剂盒就应能在各个厂牌的全自动生化仪上使用，已有技术不能在一般生化仪上使用可能的原因是其IMA试剂盒检测的IMA阴阳性OD值没有很明显的差异，信号太弱需要特别放大。由于手工分光光度仪上或中小型生化分析仪不能将微小的光电信号差别进行成一千上万倍的有效

放大，不适合使用。而我国医院的急诊化验室一般不配备大型生化分析仪，但ACS都为急诊病人，这为IMA指标在临床快速诊断心肌缺血方面推广使用形成了障碍。

2.已有技术IMA动力学曲线OD值很小的变动就可使IMA值在很大的范围内变动

根据Bar-Or D方法IMA动力学曲线，横座标OD值从阴性低值到阳性高值只在小于0.3范围内变动，而纵座标IMA值在200左右单位的大范围内变动，就是说OD值轻微变动，会引起IMA值很大的变化，这样，IMA阴性高值样品很容易变成阳性，IMA阳性低值样品很可能被高估，这种变化可能是由系统误差引起的，并不一定是由样品本身内在差异所引起，从而会造成病人缺血性状况的高估或低估，会使临床判断造成错误。

3.己有技术试剂盒及检测方法特异性不高

已有技术试剂盒检测IMA的阳性预测值(Positive Predictive Value，简称PPV)较低，主要是IMA阴性样品OD值非特异性升高，当背景干扰足够大时就可使IMA阴性结果超过临界值变成IMA假阳性，使得IMA的阳性预测值较低，某种程度上降低了IMA在临床上的使用价值。