[发明专利]一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明属于动物医学领域，特别涉及动物粪便中DNA的提取方法。

背景技术

动物肠道中存在约30个属500多种不同的细菌，约1×10¹⁰个活细菌，形成了复杂而动态平衡的微生态系统，动物胃肠道内庞大多样的微生物群落与动物的健康和疾病有密切的联系，对宿主营养物质的消化、吸收及免疫机制激活、生长发育等都起着十分重要的作用。若这种微生态平衡失调，则动物机体正常的生理功能就会发生紊乱，导致疾病的发生、流行，对畜牧养殖业尤其是规模化养殖产生了极大的潜在威胁。因而，近年来对肠道微生物区系结构及其多样性研究成为当前的热点，但由于肠道的特殊生存环境，使得肠道中有60％-80％的微生物目前无法用传统的分离培养技术进行研究，从而阻碍了人们对肠道微生物结构及其多样性的客观认识。迄今为止，肠道中只有极少部分微生物可以被培养，绝大多数还不为人所知。随着分子生物学和细胞生物学技术的发展，肠道微生物的研究也深入到了基因和作用机制水平，人们能避开了传统菌的群分离培养过程，直接从DNA水平上对这些肠道菌群进行相关研究，从粪便样品中提取高质量的、具有代表性的肠道菌群总DNA是肠道微生物生态学研究的基础。但由于粪便不但组成成分复杂(含有多聚糖、胆酸、胆盐、胆色素、腐殖质、动物肠道脱落细胞及碎片、各种无机物和有机物等PCR的强抑制物)，而且粪便中细菌类型数目繁多，而不同细菌因其各自独特的细胞壁成分和结构，又对不同的提取方法的敏感程度有所差异，从而导致了不同方法的提取效率不尽相同，进而使得肠道菌群多样性分析结果不尽如人意，甚至造成偏差。

目前粪便样品总DNA并没有标准、统一的提取方法，因而，选择较好的DNA提取方法对肠道微生态研究非常关键。目前，国内外常用的DNA提取方法主要包括机械法，如硅珠法、冻融法等；化学法，如SDS法、苯酚法等；酶法如溶菌酶、蛋白酶K等和商业试剂盒法。这几种类型的DNA提取方法中，机械法、化学法及酶或其组合方法是实验室常规提取方法。一般都是先用蛋白酶K、SDS、溶菌酶、超声波或反复冻融来裂解细胞释放出DNA，再用酚-氯仿、玻珠、二氧化硅等进行DNA的抽提，最后无水乙醇沉淀。

这几种常规的提取方法的优点是：原理清楚，便于分析及查找实验中出现的问题，而不足在于所提取的DNA纯度不高或者得率较低，常含有大量的PCR抑制物，除肠道菌基因组外，还掺杂动物细胞、食物残渣的基因组DNA及杂质，纯度不够理想，需要进一步纯化处理才能用于后续的实验操作，如用蛋白酶K裂解粪便的同时还另外用十六烷基三甲基溴化铵来除去PCR反应抑制物，并且还用酚-氯仿进行了多次的抽提才得到较高纯度的总DNA；在用蛋白酶K提取粪便样品总DNA后，再以聚丙烯酰胺葡聚糖柱子来纯化所得到的总DNA。

试剂盒法虽然操作简单、快捷、效率高，但所提总DNA浓度、得率低，价格较昂贵、处理大批样品的科研成本太高，缺乏实验室通用性，不适于用于大规模粪便样品总DNA提取。另外由于专利等其它原因，试剂盒中具体成分及其含量不是很清楚，如果发生操作失败，很难分析找出实验失败原因。因此，需要找到一种新得能快速、高质、高效、廉价及无害提取具有代表性的肠道菌群总DNA的方法。

发明内容

本发明的目的之一在于提供肉鸭粪样总DNA提取方法，操作简单、快速、高效、高质且价格经济能适于实验室大规模提取的新方法。

本发明主要包括粪便样品的预处理、样品DNA提取、PCR及电泳。以采集新鲜粪便样品或冻存的粪便样品为材料，先用PBS缓冲液等对粪便样品进行预处理，以获得粪便样品菌悬液，再以20-50μl的Clelex-100和30μL的0.15molEDTA溶液组成的混合液，共同裂解细胞释放DNA。为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：

一种简单快速的肉鸭粪样总DNA提取方法，具体包括以下步骤：

A预处理

将肉鸭粪样用缓冲液浸泡不少于5分钟后，充分震荡均匀，得肉鸭粪样混悬液；将肉鸭粪便混悬液通过离心处理，去除杂质并收集沉淀物I；离心时，可将细菌沉淀于Eppendorf管中，并通过重复离心，收集细菌沉淀I入灭菌的离心管中；

B洗涤

在步骤A所得沉淀物I中加入缓冲液，离心并去除上清液，重复离心处理至上清液无异色，得沉淀物II；

C提取