[发明专利]一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法。

背景技术

乳头瘤病毒（PV）是一类具有严格宿主范围和组织特异性的DNA病毒，感染人及动物的皮肤或粘膜上皮细胞。PV主要根据其宿主范围和基因组同源性划分型别。迄今，人乳头瘤病毒（HPV）已分为100多个型。宫颈癌占妇女癌症病死率的第2位，90％宫颈癌的发生与HPV感染有关，其中，HPV16占40-60％。因此，研究和开发HPV16的预防性疫苗，对防止HPVl6的感染及由其引起的恶性肿瘤有重要的现实意义。

在对乳头瘤病毒（PV）结构和功能的研究中发现，以L1蛋白和L2蛋白为保护性抗原构建的疫苗株很可能在预防HPV感染及其引起的恶性肿瘤方面发挥重要作用。目前国际上常通过原核和真核表达系统获得L1和L2蛋白，多用大肠杆菌、酵母等生产HPV16的L1蛋白。由于大肠杆菌等缺乏蛋白质折叠过程中需要的某些酶和辅助因子，导致中间体大量积聚，容易形成包涵体沉淀、不可溶、无生物活性等。

发明内容

为解决目前大肠杆菌、酵母等生产HPV16的L1蛋白所存在的沉淀问题，本发明的目的在于提供一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体及其构建方法。

本发明提供的一种含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体，具有SEQ ID No.1所示的HPV16的L1蛋白编码基因核苷酸序列。

所述HPV16的L1蛋白编码基因的3′端有终止子和Hind III酶切位点，5′端紧密链接HBM（Honey bee Melittin）分泌信号肽序列，其5′端有BamH I酶切位点；

所述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体，含有SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列。

所述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体，其出发载体可为pFastBac^TM 1（Invitrogen公司）、pFastBac^TMHTA（Invitrogen公司）、pFastBac^TMHTB（Invitrogen公司）、pFastBac^TMHTC（Invitrogen公司）、pFastBac^TMDual（Invitrogen公司），其中，优选pFastBac1载体（Invitrogen公司），以pFastBac1载体为出发载体构建的含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体为pFastBac1-HPV16L1。上述重组表达载体均可按照常规方法构建。

所述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体pFastBac1-HPV16L1的抗性基因为庆大霉素（Gentamicin）抗性基因和氨苄青霉素（Ampicillin）抗性基因。

本发明还提供上述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体的构建方法，包括如下步骤：

a、人工合成SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，并克隆于pGH载体，命名为pGH-B2188G；

b、BamH I和Hind III酶切消化pGH-B2188G和pFastBac1，胶回收试剂盒分别回收1668bp目的片段及4665bp载体片段，按照4:1比例，16℃连接15小时，氯化钙法转化大肠杆菌DH5α，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，筛选阳性克隆，提取质粒，得到含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体。

本发明还提供所述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体在重组蛋白质生产中的应用。

本发明还提供所述含有HPV16的L1蛋白编码基因的质粒载体在疫苗生产中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明质粒载体的成功构建和应用，可以节省HPV16的L1蛋白生产成本及时间，增加产品的安全性。

（1）以分泌表达型载体生产的重组蛋白产品活性高。分泌表达载体生产的蛋白可以进行一系列的翻译后加工，产品接近天然提取物，活性高，不易产生抗药性。

（2）避免酵母大肠杆菌等生产HPV产生沉淀问题。

（3）产品易于纯化。由于分泌蛋白，不涉及破碎细胞，直接从培养细胞的培养基内纯化蛋白，省略破碎细胞环节，没有从破碎后大量无关蛋白中分离目的蛋白而烦恼。

（4）生产成本降低。由于产品纯化环节简化，既节省了纯化时间，又减少很多无关设备的投入。

附图说明