[发明专利]筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种筛选基因调控相关机制和分子的研究方法，尤其涉及一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法。 

背景技术

真核基因调控，是一种将蕴藏在DNA序列中的遗传信息，显现为有功能的蛋白质或核酸，进而参与各项生命活动的过程。这一过程要求基因组内各基因按特定的次序在特定的时间，空间，以适当的形式和数量进行表达。基因表达调控是生命得以维持和延续的前提。虽然人们对原核基因的表达调控已经有了比较深入的了解，但由于真核基因本身结构和功能极为复杂，又缺乏有效的研究手段和技术，虽经多年巨大的努力，但相关研究的进展仍极为缓慢。时至今日，人们对真核基因的表达调控，依然所知甚少。 

真核基因是断裂基因，包括能够编码蛋白质序列的外显子和非编码的内含子序列以及非编码的调控序列。外显子能够经过翻译过程生成蛋白质，调控序列则结合相关的调控因子。在人类基因组内，编码外显子的序列仅占全序列的1%左右，非编码序列中，内含子占24%，剩余的75%为非编码的各种调控序列和大量重复序列。基因的平均长度为27kb，85%的基因长度小于100kb。 

就基因表达调控而言，每一特定基因的表达调控都可以单独进行。基因调控过程中，转录调控是最关键的环节。特定基因的转录调控是通过不同的转录因子与参与该基因调控的相关序列相结合来实现的。这些调控序列被称为顺式作用元件，与其结合的转录分子称为反式作用因子。顺式作用元件包括启动子，增强子，沉默子等。除启动子一般位于紧邻基因的上游之外，其他作用元件可以位于基因的上下游，位置无法预测。同特定基因启动子相结合的是RNA聚合酶和相关蛋白，这些因子决定该基因转录的起始。同特定基因增强子相结合的是组织特异性转录因子，决定该基因在某类组织和细胞内的表达水平。某一特 定基因的表达都是多种转录因子和不同调控序列相结合结果。在人类基因组内，能够参与基因表达调控，拥有DNA结合区段的蛋白编码基因有2600多种。这些转录因子之间可以发生复杂的相互作用，转录因子连同与它们相结合的调控序列共同构成了一个庞大基因调控网络。 

核酸内切酶是一类能够识别双链DNA上某段特定核酸序列的核酸酶。这些特定的核酸序列被称之为该核酸内切酶的酶切位点。不同的核酸内切酶拥有各自不同的特异性的酶切位点。当某一核酸内切酶同DNA上其特异性酶切位点结合后，在适当的条件下，可以在该识别位点切断双链DNA。不同核酸内切酶的酶切位点长度和序列不同。当酶切位点的长度增加时，其在基因组内的识别位点的数量会变得稀少。当识别位点长度超过一定限度后，其识别位点的数量可以稀少到一套完整的基因组内也没有一个的程度。例如，当酶切位点长度为18bp时，随机出现一个识别位点的DNA长度为4¹⁸bp，这是人类基因组的20倍。 

极稀少位点核酸酶是一类特殊的核酸内切酶，它们的酶切识别位点序列长度一般在10bp以上。其中，兆位核酸酶（meganuclease）是一类识别位点长度在12-40bp的极稀少位点核酸酶。目前已经从多种生物体内发现了数百种兆位核酸内切酶，并且新的兆位核酸酶数量还在不断增加。由于兆位核酸酶在每种生物的基因组内的识别位点极为稀少，这就为高特异性，高选择性的定向基因操作（包括基因治疗，遗传育种）等研究领域提供了广阔的应用前景。通过分析这些兆位核酸酶的结构特点，研究者们已经成功制备出经人工改造过的兆位核酸酶。这些人工兆位酶几乎能够识别任意特定的核酸序列。同时，已经有商品化的纯化兆位核酸酶在市场出售。 

由于基因组内绝大多数基因的长度都小于100kb，当包含某一基因的基因组片段足够长时，该片段的长度就可以包含该基因的完整编码序列和参与调控该基因表达的所有调控元件。在基因组计划中发展起来的大容量基因组载体库已经能够提供包含绝大多数基因完整序列的特定克隆，其中，P1人工染色体（PAC）和细菌人工染色体（BAC）能够容纳长达100-300kb的基因组片段，酵母人工染色体（YAC）可容纳500kb-1Mb的基因组片段。利用这些载体构建的基因组文库已经实现了商品化，任何一段基因组序列，几乎都能够检索到相应的载体克隆。 

目前，对这些大容量基因组载体内的基因组大片段进行定点突变，插入，删除等多项操作的分子生物学技术已经成熟，改建好的载体能够在体外大量扩增，从而可以方便的获得修饰后的基因组片段，与此相关的技术服务已经实现商品化运作。