[发明专利]筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法

权利要求书

1.一种筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

1）通过查找基因组数据库和相关载体库，找到包含有目的基因或基因组位点的完整基因组序列，并根据以往对该基因或基因位点的相关研究，确定所需基因组片段长度，所述所需基因组片段长度的范围在100kb-300kb之间；

2）对步骤1）所选定的基因组片段进行修饰，得到修饰后的基因组片段；

3）将步骤2）所得到的修饰后的基因组片段进行大量扩增纯化，并运用转基因手段将修饰后的基因组片段导入目标细胞或目标动物内，并分别形成转基因细胞或转基因动物：

4）对步骤3）所得到的转基因细胞或转基因动物施加特定刺激，所述特定刺激能够影响转基因表达调控机制，使转基因表达发生变化；

5）从步骤4）所得到的刺激后的转基因细胞或转基因动物中获取基因片段以及结合在这些基因片段上的调控蛋白；

6）分离分析与核酸结合的蛋白和相应的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于：所述步骤2）中的修饰的内容包括向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记以及向选定的基因组片段内的特定位点导入极稀少位点核酸酶的酶切位点；

所述向选定的基因组片段内的特定位点插入选择和显示标记是将抗药性基因和/或荧光蛋白等序列加入基因编码区内，利用这些遗传标记观察转入基因的表达情况，并进行定向筛选，获得成功的转基因细胞和/或动物；

所述向基因组片段内导入的极稀少核酸酶的酶切位点是一段能够为极稀少核酸酶所特异性识别的核酸序列；所述极稀少核酸酶能够识别并结合这些位点并与这些位点结合，并能够在相应的酶切位点处切断双链DNA，制备出有双链断端的DNA；所述极稀少核酸酶包括但不限于兆位核酸酶类、重组酶以及能够在特定序列处切断DNA的酶类；所述兆位核酸酶类包括内含子核酸内切酶以及归巢子核酸内切酶；所述极稀少核酸酶识别的位点长度在10bp以上；

所述修饰的实现方式是基因组载体重组工程法和/或生物合成法。

3.根据权利要求2所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于：所述步骤3）的具体实现方式是：

3.1）通过载体在特定宿主菌内扩增或通过吉布森拼接大量合成修饰后的基因组片段；

3.2）通过常规的分子克隆方法对步骤3.1）所得到的大量的修饰后的基因组片段进行分离和纯化；

3.3）运用转基因方法将步骤3.2）所得到的修饰后的基因组大片段导入目标细胞或目标动物内；

若导入目标细胞时，所述转基因方法包括但不限于脂质体转染或电穿孔转染，利用选择性培养基或标记基因筛选转染阳性细胞，建立稳定的转基因细胞；

若导入目标动物时，所述转基因方法包括但不限于原核微注射，并据此制备包含修饰后基因组大片段的转基因动物；

3.4）利用southern杂交、定量PCR、荧光原位杂交等分子生物学方法确定在转基因细胞或转基因动物体内转入的基因片段的数量；

3.5）运用蛋白电泳、特异性抗体以及组织染色等分子生物学方法分析目标基因的表达情况。

4.根据权利要求3所述的筛选真核细胞基因组内特定基因调控相关机制和分子的方法，其特征在于：所述步骤4）的具体实现方式是：

4.1）对转基因细胞或转基因动物施加特定刺激，所述特定刺激是为研究所设定的刺激，包括各种物理、化学以及其他分子生物学上可接受的刺激；所述特定刺激包括但不限于药物、损伤、激素以及生长因子；

4.2）观察转入基因的显示标记的变化，确定转入的基因表达发生了所需变化；使用交联剂将核酸和核酸结合蛋白交联固定；所述交联剂包括但不限于质量百分比浓度是0.5-1%的多聚甲醛。