[发明专利]高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生命科学与医学的交叉技术领域，特别涉及强化的免疫细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer Cell,CIK）技术领域，具体是指一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用。

背景技术

随着肿瘤对人类生存健康的威胁日益严重，应对肿瘤的治疗模式也发生着日新月异的变化，各种肿瘤治疗的新药物、新技术、新方法层出不穷，其中各种肿瘤的免疫细胞治疗非常活跃，成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向。

肿瘤的过继性细胞免疫治疗（Adoptive Cellular Immunotherapy，ACI或AIT）是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞（特异性和非特异性的）直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀肿瘤细胞，可作为手术、放疗、化疗的补充，以提高疗效和改善患者的生存质量。因此，近年来它一直是肿瘤生物治疗中最活跃的领域。

国内外在临床应用的自体免疫细胞治疗肿瘤，主要是细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-Induced Killer Cell,CIK）、树突状细胞（Dendritic Cell,DC）、自然杀伤细胞（Natural Killer Cell,NK）及γδT细胞，其他T细胞（CTL、CD3AK、DNT）也有临床应用。国内进行自体免疫细胞治疗最早在1996年开始，主要是LAK细胞。近五年主要开展的是CIK、DC细胞治疗。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是通过优化培养体系而获得增殖能力更强的异质性细胞群体。

国内外多年的临床研究表明，CIK细胞治疗可以提高患者无病生存期和总生存期，提高机体抗肿瘤免疫功能，改善患者生活质量。目前，在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health,NIH）官方临床试验网登记并正在进行的CIK细胞、NK细胞相关临床试验均达数百项之多，其中大约90％的临床试验与肿瘤治疗相关，而各种T细胞的抗肿瘤临床试验更是达到了上千项之多。欧盟与美国还先后分别于2010年和2011年批准了一个通过提高T细胞免疫活性的单克隆抗体易普利姆玛（Ipilimumab/Yervoy）用于晚期黑色素瘤的治疗。

CIK细胞是将人体外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell,PBMC)在体外用多种细胞因子共同培养而获得的一群异质性细胞，其中CD3⁺CD56⁺双阳性细胞为其主要效应细胞，具有增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、非主要组织相容性复合体（Major Histocompatibility Complex,MHC）限制性、对正常骨髓造血影响轻微等优点。特别是对于术后清除微小转移灶、防止癌的扩散和复发、提高患者自身抗肿瘤免疫能力有重要作用。对于无法手术或对化疗耐受的中晚期肿瘤患者也可起到改善生活质量、延长生命的积极作用。CD3⁺CD56⁺双阳性细胞在正常人体外周血组分中仅占3%左右，体外在含多种细胞因子的培养基中扩增，可使CD3⁺CD56⁺双阳性细胞数量扩增1000倍以上。

目前CIK细胞的传统制备方法是将分离得到的外周血单个核细胞用干扰素-γ刺激24小时后，再用CD3单抗、IL-1α、IL-2等因子进行刺激。这样得到的CIK细胞中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞含量低、细胞活力和肿瘤杀伤能力低，对肿瘤的治疗效果十分有限。另一方面，对现有CIK细胞制备方法的统计表明，有10%左右的例/次，无法从外周血单个核细胞扩增出CIK细胞，扩增过程中细胞数量没有显著增长。

因此，需要提供一种肿瘤杀伤细胞-CIK细胞的制备方法，其中CD3⁺、CD4⁺、CD8⁺的T细胞含量高、细胞活力和肿瘤杀伤能力高，对肿瘤的治疗效果好。

发明内容

本发明的目的是克服了上述现有技术中的缺点，提供一种高增殖能力、高细胞毒活性、高存活率的CIK细胞制备方法、相关CIK细胞及应用，该CIK细胞的制备方法设计巧妙，制备得到的肿瘤杀伤细胞-CIK细胞具有较强的增殖能力，较高的毒活性，具有更佳的肿瘤杀伤效率，提高临床疗效，适于大规模推广应用。