[发明专利]一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物学基因工程技术领域，具体涉及一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用。

背景技术

杆状病毒是一类在自然界中专一性感染节肢动物的DNA病毒，病毒粒子呈杆状，基因组为双链环状DNA分子，DNA以超螺旋形式压缩包装在杆状衣壳内，大小在90～180kb之间。家蚕核型多角体病毒是家蚕脓病的病原体，对于杆状病毒的研究大多数集中在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV），而对于家蚕核型多角体病毒（BmNPV，又称家蚕杆状病毒）的研究的报道甚少，所以开展家蚕核型多角体病毒的侵染机制的研究对于防治家蚕脓病具有重要的意义。

杆状病毒表面展示系统是在对病毒基因组结构和功能深刻认识的基础上发展起来的。杆状病毒表面展示系统以杆状病毒为载体，外源基因片段插入到病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间，与衣壳蛋白融合表达或与特异性的锚定部位结合表达。融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成N端融合蛋白，借助杆状病毒稳定地表达并展示于感染细胞或病毒粒子的表面，筛选得到表达有特异目的蛋白的杆状病毒粒子。外源蛋白或多肽也可与杆状病毒的囊膜糖蛋白融合，利用杆状病毒作为载体而在感染细胞的表面或病毒粒子的囊膜上获得有效的展示。在杆状病毒表面展示中，用于与外源蛋白发生融合的囊膜糖蛋白gp64是AcMNPV、BmNPV等Ⅰ型出芽病毒特有的结构蛋白，与二硫键相连以同源二聚体、三聚体或四聚体的方式存在于囊膜内及被感染细胞或病毒粒子的表面，介导病毒和昆虫细胞的融合与侵染过程。AcMNPV中gp64基因全长约512bp，是Ⅰ型跨膜糖蛋白，属于磷酸糖基化蛋白，含有2个高度疏水区，N端为带有一个内质网加工的信号肽序列，近C端是一个疏水的跨膜结构域(transmembrane domain,TM)，与TM相连的是亲水性结构域，可以把病毒囊膜内的糖蛋白与细胞膜内的糖蛋白连接在一起。外源蛋白在信号肽的C端与gp64的N端发生融合，融合蛋白经过真核细胞内质网加工后，信号肽被切除，形成的N端融合蛋白可稳定地在杆状病毒表面进行表达，形成杆状病毒“假病毒”。另外，也有将目的蛋白融合于gp64的膜锚定结构域中，即将目的基因插入到gp64基因的ORF中，这种做法虽然破坏了gp64的完整性，但可以实现目的蛋白的表达展示。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中还没有一种模式生物可以用于研究核型多角体病毒对宿主的侵入机制及后续防治该病毒药物的研制。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双标记重组家蚕杆状病毒，该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。

优选地，所述串联基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串联基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

上述双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，步骤如下：

（1）依次串联杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串联基因SP-EGFP-TM；串联杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列和红色荧光蛋白RFP基因序列，形成串联基因RFP-VP39或VP39-RFP；

（2）将串联基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体；

（3）重组杆状病毒转座载体转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养基上培养40~48小时，挑取白斑，培养20~24小时后抽提基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的为双标记重组家蚕杆状病毒。

优选地，步骤（1）杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因的扩增引物为SEQ ID NO:4~5，杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的扩增引物为SEQ ID NO:6~7，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的扩增引物为SEQ ID NO:8~9，红色荧光蛋白RFP基因的扩增引物为SEQ ID NO:10~11或SEQ ID NO:12~13，杆状病毒衣壳蛋白VP39基因的扩增引物为SEQ ID NO:14~15或SEQ ID NO:16~17。

优选地，步骤（2）所述病毒表达载体为pFastBac-Dual。