[发明专利]一种双标记重组家蚕杆状病毒及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种双标记重组家蚕杆状病毒，其特征在于，该病毒含有杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因形成的串联基因SP-EGFP-TM，以及杆状病毒衣壳蛋白VP39基因和红色荧光蛋白RFP基因形成的串联基因RFP-VP39或VP39-RFP。

2.根据权利要求1所述的双标记重组家蚕杆状病毒，其特征在于，所述串联基因SP-EGFP-TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述串联基因RFP-VP39的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述VP39-RFP的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.权利要求1或2所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）依次串联杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因、增强型绿色荧光蛋白EGFP基因和杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因，形成串联基因SP-EGFP-TM；串联杆状病毒衣壳蛋白VP39基因序列和红色荧光蛋白RFP基因序列，形成串联基因RFP-VP39或VP39-RFP； 

（2）将串联基因SP-EGFP-TM和RFP-VP39，或SP-EGFP-TM和VP39-RFP插入到病毒表达载体的多克隆位点，构建成重组杆状病毒转座载体；

（3）重组杆状病毒转座载体转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养基上培养40~48小时，挑取白斑，培养20~24小时后抽提基因组进行PCR鉴定，鉴定正确的为双标记重组家蚕杆状病毒。

4.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（1）杆状病毒囊膜蛋白gp64信号肽SP基因的扩增引物为SEQ ID NO:4~5，杆状病毒囊膜蛋白gp64跨膜域TM基因的扩增引物为SEQ ID NO: 6~7，增强型绿色荧光蛋白EGFP基因的扩增引物为SEQ ID NO: 8~9，红色荧光蛋白RFP基因的扩增引物为SEQ ID NO: 10~11或SEQ ID NO:12~13，杆状病毒衣壳蛋白VP39基因的扩增引物为SEQ ID NO: 14~15或SEQ ID NO:16~17。

5.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述病毒表达载体为pFastBac-Dual。

6.根据权利要求5所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述串联基因SP-EGFP-TM插入到载体pFastBac-Dual的P_p10启动子后的多克隆位点；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP插入到载体pFastBac-Dual的P_pH启动子后的多克隆位点。

7.根据权利要求6所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于串联基因SP-EGFP-TM是通过SmaⅠ和XhoⅠ双酶切位点插入的；串联基因RFP-VP39或VP39-RFP是通过BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点插入的。

8.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（2）所述大肠杆菌为DH10Bac。

9.根据权利要求3所述的双标记重组家蚕杆状病毒的制备方法，其特征在于步骤（3）所述PCR的扩增引物如SEQ ID NO:18~19所示。

10.权利要求1或2所述的双标记重组家蚕杆状病毒作为家蚕核型多角体病毒模式生物的应用。