[发明专利]检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，涉及检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法。

背景技术

错配识别蛋白（mismatch binding protein，MutS）是错配修复系统行使修复功能的第一个蛋白，能够识别并结合全部八种碱基错配，还能识别结合1至4个核苷酸插入或缺失形成的loop环结构引起的错配。

利用MutS的上述特殊功能，近年来己有一些研究探索MutS在检测和富集突变以及检测SNP方面的应用。其中，Rober Wanger等提出了一种利用固定化的MutS检测突变的方法，大致包括以下步骤：1）将含有MutS溶于反应缓冲液中，所述反应缓冲液为pH7.6，含有5mM氯化镁，0.1mM二硫苏糖醇，0.01mMEDTA的Tris-HCl溶液；2）将预湿的硝酸纤维膜置于48孔板中，加入含有MutS的反应缓冲液，每孔含有的MutS 500ng，室温反应20min；3）然后加入3% BSA，200μL/孔，封闭1h，洗去封闭液；4）将待测DNA溶于含有3% BSA的反应缓冲液中，并加至经步骤3）处理后的48孔板中，0.05μg/μL-0.5μg/μL，20μL，室温反应30min；5）用100μL反应缓冲液冲洗5次；6）加入含0.05μg/mL的链霉亲和素-辣根过氧化物酶（Streptavidin-HRP），含BSA的反应缓冲液，100μL/孔，室温反应20min；7）用100μL反应缓冲液冲洗5次；8）将硝酸纤维膜从48孔板中移出，用反应缓冲液冲洗，吸干，然后浸入化学发光试剂（ECL development solution, Amersham）中反应1min，吸干后用X射线拍图。

上述基于MutS检测突变的方法中检测步骤繁琐，检测效率不高，且无法直接排除检测结果中的假阴性结果，准确率不高。如果要排除检测结果中的假阴性实验结果，需要对同一样品进行重复检测，这就必然进一步降低检测效率，需要更多的待测样品，而且这种重复检测也仅仅能排除假阴性中因检测步骤中的失误引起的假阴性结果，而对于实验材料，如固定有MutS的固相载体上固定的MutS单位密度过低而引起的假阴性结果无能为力。上述方法中披露了一种固定有MutS的固相载体，在具体的检测应用中，该固定有MutS的固相载体检测步骤繁琐，检测效率不高，且至少需要两个固定有MutS的固相载体才能排除检测结果中的部分假阴性结果。基于上述方法披露的固定有MutS的固相载体形成的试剂盒同样存在上述问题。

因此需要一种新的检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法，该固相载体、试剂盒在实际应用中能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率；该检测核酸突变的方法能够减少检测步骤，提高检测效率，排除检测结果中的假阴性结果，提高检测结果的准确率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的检测核酸突变的固相载体、试剂盒和方法，旨在解决现有技术检测步骤繁琐、检测效率不高、检测结果准确率低的问题。

一种检测核酸突变的固相载体，所述固相载体表面固定有MutS；所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。

其中，所述报告基团可为荧光标记基团或无荧光标记基团。

其中，所述无荧光标记基团优选为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素。

上述任一种方案中，所述固相载体表面为适于包被蛋白的材料。

优选的，所述材料包括天然纤维素、被修饰的纤维素、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚偏氟乙烯、葡萄聚糖、尼龙、聚丙烯酰胺、琼脂糖、橡胶、金属、金属氧化物、玻片、硅片和陶瓷中的至少一种。

一种检测核酸突变的试剂盒，包括检测核酸突变的固相载体；所述固相载体表面固定有MutS；所述MutS含有报告基团；所述报告基团用于指示固相载体上MutS的数量。

其中，所述固相载体可采用本发明的检测核酸突变的固相载体中的任一种。

其中，所述试剂盒还可包括标准品；所述标准品包括阳性标准品和阴性标准品；所述阳性标准品为含有碱基错配或由1至4个核苷酸缺失或插入引起的错配的双链核苷酸分子；所述阴性标准品为完全互补的双链核苷酸分子。

其中，所述试剂盒还可包括用于扩增特定区域的特异性引物。

上述任一种方案中，所述报告基团为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、亲和素或链霉亲和素；所述试剂盒还包括显色试剂；所述显色试剂，用于与所述报告基团反应进而指示固相载体上MutS的数量。