[发明专利]短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种短链脱氢酶及应用，特别涉及短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及在不对称还原羰基化合物中的应用。

（二）背景技术

β羟基酯是医药、农药、材料及其它精细化工原料的重要组成部分，如4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE），是一种重要的有机合成的中间体，分子中有三个功能基团（-OH，-Cl，-COOH），可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。其手性单体（R/S）-CHBE都是非常有前景的手性物质。R-CHBE可以作为合成L-肉毒碱，(-)-大内酰亚胺A，R-γ-氨基-β-羟基丁酸的关键中间体，还可以转化为负霉素。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物，2007年全球销售额达到160亿美金）和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药物，具有重要的应用价值和广阔的市场。

目前以4-氯乙酰乙酸乙酯为原材料来制备CHBE主要有化学法（手性钌催化剂还原法）和生物催化法两种方法。化学不对称合成方法采用手性催化剂如2,2’-二联苯膦基-1,1’-联萘钌配合物(2,2’-bos(dipHenyIpHospHino)-1,1’-binapHthyl ruthenium complex)作为不对称还原催化剂，该方法反应条件苛刻，需使用高压氢，对反应器要求较高；反应须在高温下进行，能耗比较高；所用的含铑或钌的催化剂价格昂贵且不易获得，因此成本较高；同时由于以金属为催化剂，使得很多制备的药物中金属含量超标，达不到安全使用的标准，无形中增加了生产成本。生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。生物不对称还原方法利用可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯的重组酶，例如短链脱氢酶，酮还原酶等来不对称还原得到手性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

微生物是羰基还原酶和醇脱氢酶的好来源，大量的文献报道了微生物来源的酶法制备手性CHBE的情况。

1990年Shimizu S等人（Microbial asymmetric reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate to optically active ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnology Lett,1990,12(8):593-596）用微生物菌体进行COBE的还原反应生成(S)-CHBE，产率为85％，光学纯度91％e.e.。同年，Sakayu S等人（Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by a microbial aldethde reductase in an organic solvent-water dipHasic system.Appl Environ Microbiol,1990,56(8):2374-2377）用能同时表达乙醛还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌转化细胞作为催化剂，在有机溶剂-水(乙酸正丁酯-水50mL/50mL)两相体系中催化反应，50小时后，(R)-CHBE的摩尔转化率为62.5％，e.e.值为92.2％。

1999年Yasohara等（Synthesis of optically active ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction.Appl Microbiol Biotechnol,1999,51:847-851）在葡萄糖存在下从200株酵母菌中筛选到了13株有COBE还原为(S)-CHBE能力的菌株，但所得到的结果并不理想，产率低，还原的立体选择性不高且随培养条件而改变。于是考察在水/乙酸正丁酯的双相体系中用细胞丙酮干粉进行还原反应，发现Candida magnoliae在葡萄糖、NADP和GDH的水／乙酸正丁酯的双相体系中可还原90g/L的(S)-CHBE。当细胞经热处理后，还原的立体选择性增加到99％e.e.。