[发明专利]海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物及其设计和扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋鱼类线粒体基因组研究领域，具体涉及一种高效扩增多种海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物及其设计和扩增方法。

背景技术

鱼类线粒体DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）呈共价闭合环状结构，包括一条轻链及一条重链，是细胞核外相对独立的复制单位。相比于核DNA，鱼类线粒体DNA具有拷贝数多、分子结构简单、编码效率高、进化速度快、母系遗传及不同区域存在不同进化速率等特点。由于鱼类线粒体DNA所具有的这些特点，使其成为鱼类分子群体遗传学、系统发生学及保护生物学等研究领域的重要分子标记。与其他脊椎动物类似，鱼类线粒体DNA由13个编码蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因（12S rRNA及16S rRNA）共37个编码基因及一段主要的非编码控制区组成。12S rRNA作为编码线粒体中一种核糖体RNA的基因，与线粒体DNA上其它基因相比，在进化上较为保守，但种间变异度较大，是进行鱼类群体遗传结构评估、相似种类及系统发生关系等研究领域的重要遗传标记，特别在研究鱼类系统发生关系中，12S rRNA基因广泛地被应用于种、属、科、目不同分类阶元，是一种理想的分子标记。

目前，利用线粒体12S rRNA基因序列作为分子标记被广泛地应用到鱼类分子群体遗传学及系统发生学等领域，然而却缺乏扩增鱼类线粒体12S rRNA基因的通用引物，给相应的研究带了一定的困难。国内外关于12S rRNA通用引物的报道主要有：Springer等(Mol. Biol. Evol, 1995, 12: 1138-1150)设计的针对哺乳动物线粒体12S rRNA基因引物及Wang等(Zoological Studies, 2000, 39: 61-66)设计的脊椎动物线粒体12S rRNA基因通用引物。然而设计模板序列的选取、设计方法的不同以及通用引物自身扩增能力的局限性，利用已报道的通用引物扩增以虾虎鱼类及石首鱼类为主的多种海洋鱼类均存在着一定的不稳定性，因此设计新的针对鱼类线粒体12S rRNA基因通用引物，同已报道的引物进行互补，对于有效获得绝大多海洋数鱼类线粒体12S rRNA基因序列是十分必要的。

发明内容

针对上述现有技术存在的缺点和不足，本发明旨在提供一对可高效特异扩增多种海洋鱼类线粒体12S rRNA基因的单链寡核苷酸引物，从而为快速有效获取鱼类线粒体12S rRNA基因序列以进行种类鉴定、种质资源调查及系统进化研究提供一个有力工具。本发明的目的还在于提供所述海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物的设计方法，以及利用所述的海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物对海洋鱼类线粒体12S rRNA基因进行扩增的方法。

为实现本发明的发明目的，发明人提供如下技术方案：

海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物，由两条单链寡核苷酸链组成，其中轻链引物为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重链引物为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

本发明的轻链引物Marinefish-12SrRNA-F（SEQ ID No.1所示）有22个碱基：ACTAAAGCATAACACTGAAGAT，位于tRNA-Phe基因上；重链引物Marinefish-12SrRNA-R（SEQ ID No.2所示）有22个碱基：TTCATTTCTCTTTCAGCTTTCC，位于16S rRNA基因上。

本发明所述的海洋鱼类线粒体12S rRNA基因扩增引物对在东海海域采集的46种海洋鱼类，以及1种淡水鱼类的DNA模板溶液进行PCR扩增，均能获得片段长度为1200bp左右的特异性扩增产物，经测序及与GenBank中同源序列的比较，确认为包含12S rRNA基因全序列、tRNA-Val全序列及长度为146bp左右的16S rRNA基因序列的扩增产物，体现出本发明较广的扩增范围与较强的扩增能力，从而为快速有效获取海洋鱼类线粒12S rRNA基因序列以进行种类鉴定、种质资源调查及鱼类系统进化研究提供一个有力工具。