[发明专利]食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测领域，尤其是涉及一种食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

变态反应性疾病是现代社会中常见的一种疾病，它是由广泛存在的变应原引发的，我国大约有5-10％的人受变应原的侵扰。引发过敏反应的物质称为变应原，其中食物是一种重要变应原。人体对食物敏感可引起食物变态反应，目前认为主要有两种类型：由IgE介导的速发型过敏反应，反应通常发生迅速，病症明显；由IgG介导的迟发型变态反应，此种反应通常在接触食物几小时或几天后才会出现反应症状，如长期疲劳、关节炎、荨麻疹、湿疹、头痛、肠胃功能失调及其它慢性症状。通常情况下，将由食物引起，IgG介导的异常反应称之为食物不耐受。食物不耐受患者体内会产生食物特异性IgG抗体，检测血清特异性IgG抗体对于确定不耐受食物鉴别和诊断具有重要价值。目前临床上常采用检测特异性抗体来确定引起患者不耐受的食物类型，而酶联免疫吸附实验是常用的检测方法。

传统的食物变应原IgG抗体酶联免疫检测法通常采用的都是直接包被模式，即由生产厂家预先将变应原固相化于作为载体的聚苯乙烯微孔板上，供检测人员直接使用。其原理是将变应原成份包被于固相载体表面，用其结合患者血清中的特异性抗体，再通过进一步结合酶标记抗体进行显色反应来判断结果，从而确定患者血清中是否存在包被抗原所对应的特异性抗体。然而，引起食物过敏的物质种类繁多，同一患者可对多种食物过敏，并且存在明显的个体差异。在检测时往往需要同时进行多种变应原的检测，而每一个患者所需的检测组合又各不相同。

传统试剂常常由生产厂家将多种变应原同时包被于微孔板制成类似套餐性质的检测组合，由于采用直接包被法，组合方式无法改变。而实际工作中，每一患者的检测需要各不相同，食物过敏组合是个性化的，这往往与厂家提供的项目组合产生冲突，造成多余的检测和漏检，同时会增加检测成本。例如：目前国内实验室主要使用由BIOMERICA公司生产的酶联免疫法试剂盒，该试剂盒可同时检测6例患者，每例患者可检测(必须检测)14种食物变应原，组合方式不能改变。此外，该试剂盒在固定位置可测定2条标准曲线，对血清特异性IgG进行定量。因此，此试剂盒只能进行两次测定，每次测定3例患者血清。

发明内容

为了克服传统直接包被模式制备的食物过敏酶标反应板无法满足患者个性化需求的不足，本发明引入生物素-链霉亲和素间接包被模式，对酶标反应板的包被制作环节进行改进。变应原不需预先包被，而是标记上生物素，与包被了亲和素的微孔反应板同时提供给检测人员。检测人员可以根据被检者的具体情况灵活选择所需食物变应原，将生物素标记变应原和待测血清同时加入微孔板，实现即时包被，并且包被和检测过程同步进行，大大降低了检测成本，提高了检测灵活性，真正实现个性化检测。

生物素(biotin，B)分子量为244.31，现已能人工合成，制备方便。生物素基本结构为双环结构：I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的部位；II环为噻吩环，含一个戊酸侧链，其末端羧基可与生物大分子连接，形成生物素标记抗原、抗体等。生物素与生物大分子结合后并不影响生物大分子和生物素原有的生物活性，即生物素标记抗体同时具备与亲和素和相应抗原结合之特性。

链霉亲合素(streptavidin，SA)，分子量65KD，由四条相同的肽链组成，一个链霉亲合素分子能结合四个生物素分子。与亲和素相比，链霉亲和素对生物素具有高度亲和力(亲和常数为10¹⁵/mol)，与生物素结合后形成非常稳定复合物，很难解离。基于生物素与链霉亲和素相结合这一特性所建立的体系称为生物素-亲和素系统。

本发明采用的技术方案是：

一种食物不耐受血清特异性IgG酶联免疫检测试剂盒，主要包括：

(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；

(2)生物素标记的食物变应原；

(3)生物素标记抗人IgG抗体；

(4)人IgG标准品；

(5)阳性质控血清；

(6)酶标记抗人IgG抗体

(7)常规酶标清洗液

(8)显色液A：含0.054％(V/V)H₂O₂的磷酸盐柠檬酸缓冲液；

(9)显示液B：含0.48g/L TMB的柠檬酸缓冲液；

(10)终止液：1mol/L H₂SO₄溶液。

本发明试剂盒的主要作用过程如下：