[发明专利]食物不耐受血清特异性IgG检测试剂盒及其制备方法

权利要求书

1.一种食物不耐受血清特异性IgG酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：

(1)预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；

(2)生物素标记的食物变应原；

(3)生物素标记抗人IgG抗体；

(4)人IgG标准品；

(5)阳性质控血清；

(6)酶标记抗人IgG抗体；

(7)常规酶标清洗液；

(8)显色液A：含0.054％(V/V)H₂O₂的磷酸盐柠檬酸缓冲液；

(9)显示液B：含0.48g/L TMB的柠檬酸缓冲液；

(10)终止液：1mol/L H₂SO₄溶液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：

预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板的每个微孔中包被有0.75微克的生物素化牛血清白蛋白和0.45微克的链霉亲和素；

生物素标记的食物变应原的蛋白浓度为10-20微克/毫升，优选15微克/毫升；

生物素标记抗人IgG抗体的蛋白浓度为2-4微克/毫升，优选3微克/毫升；

用于做标准曲线的人IgG标准品含有六个浓度，分别是0U/ml、50U/ml、100U/ml、200U/ml和400U/ml。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的食物变应原为牛奶变应原、鸡蛋变应原、虾变应原、小麦变应原、花生变应原、腰果变应原、蟹变应原和黄豆变应原中的一种或几种。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述试剂盒的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)在酶标反应板上包被生物素化牛血清白蛋白，再进一步连接链霉亲和素，得到预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板；

(2)用生物素标记食物变应原；

(3)制备生物素标记抗人IgG抗体；

(4)预包被了生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板、生物素标记的食物变应原、生物素标记抗人IgG抗体、人IgG标准品、阳性质控血清、酶标记抗人IgG抗体、常规酶标清洗液、显色液A、显示液B和终止液组装成成品。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤(1)包括如下步骤：

[1]配制稀释液I、稀释液Ⅱ、封闭溶液；

稀释液I由如下组分制备得到：

调pH至8.0，加0.5ml Procilin 300，加ddH₂O定容至1L；

稀释液II由如下组分制备得到：

调pH至8.0，加ddH₂O定容至1L；

封闭溶液由如下组分制备得到：

调pH至   7.3-7.5

BSA      2.0g

蔗糖     17.5g

Procilin 300 0.25ml

加ddH₂O定容至500ml；

[2]配制生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液

用稀释液I将生物素化牛血清白蛋白稀释至5μg/ml；

[3]配制链霉亲和素包被缓冲液

用稀释液I将链霉亲和素稀释至3μg/ml；

[4]制备预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板

①在空白酶标反应板的每个微孔中加入150微升生物素化牛血清白蛋白包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴16-18小时；

②甩净包被缓冲液，用稀释液I洗酶标反应板2次，300微升每孔，每次静置10分钟；

③甩净稀释液，并拍干；

④在酶标反应板的每个微孔再加入150微升链霉亲和素包被缓冲液，将酶标反应板放在密封的容器内，18-25℃，温浴2小时；

⑤甩净包被缓冲液，用稀释液II洗酶标反应板2次，300微升每孔，每次静置10分钟；

⑥甩净稀释液，并拍干；

⑦在酶标反应板的每个微孔再加入250微升封闭溶液，将酶标反应板放在密封的容器内，4℃，温浴过夜；

⑧甩净封闭溶液，并拍干，将酶标反应板真空干燥至少6小时，得预包被生物素化牛血清白蛋白-链霉亲和素的酶标反应板。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：用生物素标记食物变应原包括如下步骤：

①将纯化好的用于检测特异性抗体的变应原调整为5毫克每毫升，分别用0.1摩尔每升，pH9.5的NaHCO₃缓冲液透析，过夜，并于280nm处测吸光度值，计算蛋白蛋白总量，得蛋白溶液；

②将活化的生物素溶于二甲基甲酰胺中，按照生物素与变应原的摩尔比为20∶1的比例，将生物素缓慢滴入蛋白溶液中，边滴加边搅拌，全加入后室温搅拌条件下继续反应1h；

③将反应后的液体用0.1摩尔每升的PBS于4℃透析24小时，充分除去未结合的生物素后，即得到所述生物素标记的变应原。