[发明专利]克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养技术、胚胎工程与发育生物学领域，更具体地，涉及一种克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法。

背景技术

哺乳动物胚胎体外发育培养技术是胚胎发育生物学、转基因、动物克隆等研究的重要技术平台，建立稳定的体外胚胎培养体系和提高胚胎发育效果显得尤为重要。

在正常生理条件下，胚胎的发育主要从输卵管和子宫壁腺体分泌物中汲取营养。但是，在体外培养条件下，培养液模拟的体外环境对早期胚胎的存活和发育是至关重要的，通常在一些化学成分确定的培养基中，受精卵往往不能发育到囊胚，而是停顿在某个特定的发育时期。这种现象被称作发育阻滞现象(Development Block)。发育阻滞的时期随物种不同而异，例如，大鼠和小鼠的发育阻滞发生在2-细胞期，人发生在4-8细胞期，牛、羊等发生在8-16细胞期，猪为4细胞期，兔发生在桑葚胚期。因此，早期胚胎发育阻滞是哺乳动物胚胎体外培养过程中普遍存在的问题。现行的各种体外培养条件下受精卵发育到囊胚的比率仍不十分理想，有报道称牛卵母细胞经过体外成熟、体外受精、体外培养后仅有30%～40%的受精卵可以顺利发育至囊胚阶段，大部分的受精卵发育至8-16细胞后由于不能克服“发育阻滞”现象而发生细胞凋亡，不能发育至囊胚阶段，而且得到的胚胎其质量与体内受精胚胎相比仍有较大差距。大量的研究表明，体外培养胚胎与体内胚胎相比，体外培养的胚胎在形态学和发育速度上存在显著差异。目前所用的各种培养系统还不能完全模拟雌性生殖道内提供给胚胎的有利环境，体外的培养环境对早期胚胎并非完全适宜，不适的体外培养条件使得胚胎的发育潜力严重受损，这种现状己成为限制相关技术应用与发展的瓶颈之一。

近年来随着共培养系(Co-culture system)的开发和应用，体外受精胚胎仅在试管内便可培养发育为可移植胚胎。与在简单培养液中的培养相比，共培养的优势源于与简单培养液共同起作用的体细胞。共培养体系通过分泌一些对早期胚胎发育有利的物质和代谢降解胚胎发育过程中产生的有毒物质等，在体外为胚胎发育提供一种更类似于体内的环境，能在一定程度上克服胚胎体外发育阻滞，促进早期胚胎发育，提高胚胎质量，增加胚胎着床率和妊娠率，降低流产率。但共培养涉及到大量的干扰因素，包括制作辅助细胞程序复杂、体细胞的类型、可能增加污染机会且会作为疾病转播的媒介物等等。

    因此，该研究领域迫切需要开发一种新的提高哺乳动物体外受精胚胎早期发育率的培养液和培养方法。

发明内容

本发明首先要解决的技术问题和提出的技术任务是克服利用现有胚胎培养液胚胎发育成功率不高的缺陷，提供一种可以兼做牛体外受精胚胎的体外培养液；其次是提供这种牛体外受精胚胎培养液的配制方法；再次是提供一种体外受精胚胎培养液的培养方法。为此，本发明采取以下技术方案：

一种牛体外受精胚胎培养液，是以常规细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础培养液培养牛输卵管原代上皮细胞，然后收集该培养液添加BSA、丙酮酸钠及血清。

所述培养液BSA的含量为3 μg/mL；所述丙酮酸钠的含量为0.2 mM ；所述血清的体积百分含量为 5%—10%。

一种牛体外受精胚胎培养液的配制方法，是以常规组织细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础培养液培养牛输卵管上皮细胞原代细胞2—3天，收集该培养液后添加BSA、丙酮酸钠及体积百分含量为5%—10%的血清。

所述牛输卵管上皮原代细胞培养液的收集是将卵巢带黄体的黄牛或牦牛输卵管在无菌条件下用m-PBS反复冲洗输卵管几次，去除血污后用眼科剪和眼科镊分离、剪去周围的粘连组织。在平皿中将输卵管纵向剪开，平展在平皿中，用手术刀刮取输卵管上皮细胞，加0.25%胰酶消化15 min，加入血清终止胰酶消化。消化过程中要吹打数次使内膜充分消化。吸取消化液，经滤网过滤后至5 mL离心管中1000 r/min，离心5 min，弃上清液，加入基础培养液，调整浓度为10⁶个/mL细胞悬液，接种至25 cm²或75 cm²培养瓶中，置39°C、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养2—3天后，收集培养液，0.22 μm过滤除菌后-20°C保存。

所述收集培养牛输卵管上皮细胞培养液常温解冻，添加BSA、丙酮酸钠和血清后，0.22 μm过滤除菌4°C备用。