[发明专利]克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法

权利要求书

1.一种牛体外受精胚胎培养液，是以常规细胞培养液为基础培养液，其特征是用基础细胞培养液培养牛输卵管原代上皮细胞，然后收集该培养液添加BSA、丙酮酸钠及血清。

2.根据权利要求1所述的牛体外受精胚胎培养液，其特征是基础细胞培养液培养牛输卵管上皮细胞2-3天后，收集细胞培养液，过滤除菌。

3.根据权利要求1所述的牛体外受精胚胎培养液，其特征是所述的基础细胞培养液为TCM-199。

4.根据权利要求1或2所述的牛体外受精胚胎培养液，特征是所述培养液添加BSA含量为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%。

5.根据权利要求1和2所述的牛体外受精胚胎培养液，特征是用细胞基础培养液培养的输卵管上皮细胞为黄牛输卵管上皮细胞或牦牛输卵管上皮细胞。

6.根据权利要求1或2所述的牛体外受精培养培养液，所述添加BSA和丙酮酸钠为细胞培养级试剂。

7.根据权利要求1或2所述的牛体外受精胚胎培养液，所述添加血清为胎牛血清或新生牛血清。

8.一种牛体外受精胚胎的培养液的配置方法为，其特征是用基础细胞培养液培养黄牛或牦牛输卵管上皮细胞2-3天后，收集细胞培养液，经0.22 μm滤器过滤除菌，添加BSA含量为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%。

9. 根据权利要求8所述的培养液-4°C保存一星期，-20°C长期保存。

10. 一种牛体外受精胚胎培养液的培养方法，其特征是用基础细胞培养液培养牛输卵管原代上皮细胞2-3d，然后收集该培养液添加BSA为3 μg/mL 、丙酮酸钠含量为0.2 mM和血清的体积百分含量为 5%—10%后作为体外胚胎的培养液，做成培养微滴并覆盖石蜡油在39°C、5% CO₂饱和湿度CO₂培养箱中平衡。

11.根据权利要求10所述的牛体外受精胚胎培养液的培养方法，其特征是所培养的体外胚胎为牦牛或黄牛的卵母细胞经体外成熟培养，用牦牛或黄牛的精液经过同种或异种体外受精获得的受精卵。

12.根据权利要求10或11所述的牛体外胚胎培养液的培养方法，其特征是于培养前两小时，在60 mm灭菌培养皿中，用上述培养液做成50 μL的培养小滴。

13.根据权利要求10、11或12所述的牛体外胚胎的培养液的培养方法，其特征是体外受精获取受精卵培养48 h 观察卵裂率，每两天半量换液，培养至7—9天，观察桑葚胚、囊胚和孵化囊胚的发育率。