[发明专利]新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统

说明书

技术领域

本发明通过对原有狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统进行改造，构建新型的反向遗传系统，为研制安全、稳定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定基础。 

背景技术

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus）引起的一种急性、动物源性人兽共患传染病，病毒感染人或动物后，病死率几乎达100％，是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。据世界卫生组织(WHO)报告显示，全世界每年因狂犬病死亡人数达55000人，其中99%发生于亚洲和非洲，仅亚洲每年大约死亡35000～40000人。目前，狂犬病尚无有效的治疗手段，接种疫苗仍是预防狂犬病唯一有效的方法。因此，在我国需要对犬进行大规模的免疫接种及加强对人暴露前和暴露后预防免疫，这是降低我国狂犬病的发病率的一项有效措施[参见：俞永新. 中国预防控制狂犬病降低发病率的思考[J].中国计划免疫, 2007, 13 (4):391-397.]。 

目前，狂犬疫苗主要以细胞培养疫苗和减毒活疫苗为主。由于人用狂犬疫苗价格和产量的原因，狂犬病的预防免疫需要的费用较高，而且往往需要多次接种，一般家庭难以承受。对于兽用疫苗，普遍应用的为减毒活疫苗，数量严重不足而且质量往往的不到保证，注射后还存在发生狂犬病的潜在危险，WHO狂犬病专家并不主张用减毒活疫苗注射免疫动物(参见：WHO. Expert Committee on Rabies[M].1st report, Geneva: WHO.2005.931.)。因此，非常有必要研发一种安全、稳定、高效和廉价的新型狂犬疫苗。 

CTN 株狂犬病病毒的亲代病毒为1956 年在山东省淄博市一个感染狂犬病的病人脑组织中分离得到，经鼠脑和人二倍体细胞连续多次传代得到的减毒疫苗株，并于1983年和2005被世界卫生组织（WHO）批准作为中国狂犬病疫苗生产用毒株。基因序列分析表明，CTN株与我国各病毒株的核苷酸同源性为82％~93％，大于其他疫苗株与街毒代表株间的同源性，表明该疫苗能有效预防我国目前流行的狂犬病[参加：盂胜利, 徐葛林, 明平刚, 等. 狂犬病毒疫苗株CTN-1八代次N和G基因序列测定及分析[J].中国人兽共患病学报,2007,23(4):327-332.]。 

RNA病毒反向遗传技术的核心是构建RNA病毒的全长cDNA分子，在DNA水平上可对该cDNA可进行各种修饰或改造，通过体外转录过程可再次得到病毒RNA，将这些经改造的RNA转染细胞，即可获得改造后的新病毒。这项新技术为RNA病毒分子生物学研究开辟了新途径，也为新型疫苗的研发提供了有力的工具。近年来，狂犬病病毒的反向遗传学研究进展迅速，相继有六株狂犬病病毒株：SAD B19，RC-HL，HEP-Flury，SHBRV，HN10和CTN 的感染性克隆构建成功，狂犬病病毒反向遗传体系构建策略不断完善，为研发新型的狂犬病减毒活疫苗奠定了基础。 

研究表明：G蛋白是狂犬病病毒颗粒的表面膜蛋白，是诱发中和抗体的唯一抗原，对狂犬病病毒致病性和免疫原性起关键作用。G蛋白上的333位精氨酸或赖氨酸是狂犬病病毒致病决定因子，这个残基被选为产生减毒株的靶位点(参见：Tuffereau C, Leblois H, Benejean J, et al. Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVS glygoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice [J].Virology,1989, 172(1):206-212.)；而G蛋白中194位的天冬氨酸替换为丝氨酸可以增加狂犬病病毒的遗传稳定性(参见：Faber M, Faber M L., Papaneri A, et al. A single amino acid change in rabies virus glycoprotein increases virus spread and enhances virus pathogenicity[J]. J. Virol. 2005, 79:14141–14148.)。 

发明内容