[发明专利]新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统

权利要求书

1.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，该反向遗传系统是对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中G蛋白第194位和第333位氨基酸位点实施了定点突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸。

2.根据权利要求1所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统，其特征在于，含有一个、两个或／和三个突变后G蛋白基因的全长感染性克隆。

3.权利要求1或2所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统在拯救狂犬病病毒疫苗株中的应用。

4.一种新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统的构建方法，包括以下步骤：

步骤一：应用基因定点突变技术对狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遗传系统中的G蛋白基因进行突变，使G蛋白第194位氨基酸由原来的天冬酰胺突变为丝氨酸，第333位氨基酸由原来的谷氨酰胺突变为谷氨酸，具体方法是：将要突变的G蛋白基因扩增后克隆到pGEM-T载体，利用以下引物：

m-F1：5’-TGTGATATTTTCACCAGCAGCAGAGGGAAGAGA-3’

m-R1：5’-TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’

m-F2：5’-TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3’

m-R2：5’- ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’

对G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位点进行定点突变，将突变后的G蛋白基因命名为GAS基因，将得到的突变后的重组质粒命名为pGEM-GAS；

步骤二：利用以下引物分别扩增GAS基因：

G-F1：5’-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3’与G-R3：5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F4：5’-GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R35’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F2：5’-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3’G-R25’-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

G-F3：5’-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’与G-R3：5’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’；

将PCR产物切胶回收后与pGEM-T载体进行连接，构建成重组质粒pGEM-GAS₁、pGEM-GAS₂、pGEM-GAS₃、pGEM-GAS₄；

步骤三：人工合成含有BssHⅡ、AsiSⅠ、AscⅠ、AscⅠ酶切位点的linker并与pMD18-T载体连接，得到中间载体pMD-MCS；

步骤四：利用内切酶BsiWⅠ、NheⅠ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS₁进行双酶切，酶切产物切胶回收后进行连接构建成重组质粒pCTN-GAS。

步骤五：利用内切酶BsiWⅠ、BssHⅡ分别对pCTN-GFP和 pGEM-GAS进行双酶切后连接构建pCTN-GAS-GFP；随后，利用内切酶BssHⅡ、NheⅠ分别对pCTN-GAS-GFP和 pGEM-GAS₂进行双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGAS。

步骤六：利用内切酶AscⅠ、NheⅠ分别对pMD-MCS和 pGEM-GAS₄进行双酶切后连接构建重组质粒pMD-GAS₄；随后，利用内切酶AsiSⅠ、AscⅠ双酶切pMD-GAS₄和 pGEM-GAS₃后连接构建pMD-GAS₃GAS₄；将pMD-GAS₃GAS₄ 利用内切酶AscⅠ单酶切后切胶回收，再利用S1核酸酶处理去掉突出的碱基，经T4 DNA 连接酶连接以去除AscⅠ酶切位点，处理后的pMD-GAS₃GAS₄ 与pCTN-GAS-GFP经BssHⅡ、NheⅠ双酶切后连接构建成重组质粒pCTN-GASGASGAS。