[发明专利]复杂天然产物中活性成分筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明属天然药物筛选领域，具体地说是涉及一种从中药及天然产物等复杂天然产物中快速分离制备、分析和活性评价的一体化方法，用于复杂天然产物中活性化合物的筛选。

背景技术

天然产物中含有丰富的具有生物活性的成分，是开发新药候选化合物的巨大资源库。但是目前针对天然药物的开发并没有形成如化学药物开发那样的规模，其中最大的技术难度在于天然产物的分离制备与高通量筛选的样品要求之间存在差距。常规的植化方法大都采用有机溶剂对天然产物进行系统分离，制得的样品需要干燥、称量、溶解、配制、加样等一系列步骤后才能在微孔板中进行高通量筛选，存在耗时耗力等问题。因此，开发一种快速分离制备与活性评价紧密结合的系统可以极大地提高天然药物中活性化合物发现的速度。

目前，国内外针对天然产物中活性化合物的快速筛选发现已提出了几种研究思路，如构建多通道逆流色谱与高通量分馏相结合构建的自动化组分制备系统，已应用于一些中药复方的组分快速制备；又如应用液相色谱与傅里叶变换质谱联用，结合微孔板分光光度计来筛选柴胡疏肝散中的抗氧化活性成分。这些分离筛选方法，可以提高天然产物中活性成分筛选效率，降低实验成本和时间。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种复杂天然产物中活性成分筛选方法，是一种在复杂天然产物中通过并行分离制备、分析筛选活性成分的方法，通过以下步骤实现： 

（1）样品并行制备

将待测样品（天然产物提取物、中药提取物或含多种化学成分的混合物样品）配制成溶液，分别取10-50μL溶液，通过自动进样器或手动进样器注入并行制备系统，并行制备系统由二元液相色谱泵，5根并行连接的色谱柱以及4台馏分收集仪组成（可根据需求扩展），将其中4根色谱柱的洗脱液，采用4台自动馏分收集仪分别收集至4块微孔板，每孔中馏分体积根据微孔板容积确定。

（2）样品分析

　　将上述并行制备系统中剩余1根色谱柱的洗脱液通过管线与紫外/可见光检测器相连，然后再接入电喷雾－质谱仪，对步骤(1)制备的样品进行定性分析。

（3）样品处理

　　通过常规离心浓缩等方法，挥干4块收集有相同馏分的微孔板中的溶液，再加入一定量溶剂溶解后，作为活性评价的待测样品。

（4）活性评价

　　在微孔板上，采用基于细胞、酶或者化学反应的活性评价方法对微孔板中各孔对应的馏分的活性进行评价，发现其中具有显著活性的馏分。基于细胞的活性评价方法包括肿瘤细胞的细胞活力测试、损伤的内皮细胞及心肌细胞活力测试等，可用于评价馏分的抗肿瘤、内皮保护及心肌保护活性。基于酶的活性评价方法包括alpha-葡萄糖苷酶、脂肪酶、酪氨酸酶、乙酰胆碱酯酶等酶活力测试，可用于评价馏分的酶抑制活性；基于化学反应的活性评价方法包括自由基清除活力测试，可用于评价馏分的抗氧化活性。

（5）活性成分筛选

综合处理液相色谱－质谱联用分析数据和活性评价数据，确定活性馏分在液相色谱－质谱联用分析图谱中的位置，并进一步提取与该馏分相对应的化合物的紫外光谱、分子量、分子碎片等化学信息，推断活性化合物结构，筛选出活性成分。通过制备纯化目标化合物或购买目标化合物标准品等方式，获取活性成分，再采用活性评价方法验证目标化合物的药效活性。

本发明的另一个目的是提供所述方法在复杂天然产物中筛选活性成分中的应用。所述复杂天然产物包括天然产物提取物、中药提取物或含多种化学成分的混合物。

本发明应用多通道高效液相色谱作为分离单元、质谱作为联用的检测分析单元、各型号孔板自动馏分收集仪作为收集单元与药效活性评价单元，上述单元构成了一体化的天然产物分离分析与活性快速筛选系统。/可见光检测器相连然后与电喷雾质谱仪相连，构成一体化的分离分析检测系统；从高效液相泵分出来的另一路管线与多个进样器相连后与多通道并行的色谱柱连接作为并行分离系统，然后通过毛细管与各型号孔板自动馏分收集仪连接作为自动收集系统，在本系统进行分离制备后可一次得到多块孔板，可进一步进行基于细胞、酶或者化学反应的活性评价，活性筛选数据又可以与分析检测数据进行比对分析得到活性化合物信息，实现了分离制备、分析检测与活性筛选的连贯结合。[51] 

本发明提供了一种针对复杂样品的并行分离制备、分析和自动收集方法，使之具有能与药效活性筛选连贯结合的特点，具有快速分离、自动收集和活性快速筛选结合等显著优点。该系统的优点在于采用5通道并行液相色谱进行天然产物的分离，并能够将样品直接制备到匹配的微孔板中，用于活性快速筛选。