[发明专利]一种检测干细胞注射液中细菌的方法有效

专利信息
申请号: 201210306849.2 申请日: 2012-08-27
公开(公告)号: CN102808032A 公开(公告)日: 2012-12-05
发明(设计)人: 刘拥军;朱德琳;陈博;徐萌 申请(专利权)人: 天津和泽干细胞科技有限公司
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 300381 天津市河西区空港经济*** 国省代码: 天津;12
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摘要:
搜索关键词: 一种 检测 干细胞 注射液 细菌 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及生物技术领域,特别是涉及细菌的快速检测方法。

背景技术

近年来,干细胞可塑性研究为各种免疫类型疾病的治疗提供了一个新的方向。干细胞免疫疗法是通过调控细胞因子,修复受损的组织细胞,然后通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制受损细胞的增殖及其免疫反应,从而发挥免疫重建的功能。这种治疗方法在观念上完全不同于传统的药物治疗方法,其主要是通过修复人体免疫细胞来治疗疾病。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是干细胞家族的重要成员,来源于发育早期的中胚层和外胚层。间充质干细胞是干细胞的一个研究分支,因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而应用于治疗治疗临床上一些难治性疾病,如血液系统疾病、心血管疾病、肝硬化、神经系统疾病、膝关节半月板部分切除损伤修复、自身免疫性疾病等,根据初步的临床报告,间充质干细胞对这些疾病的治疗都取得明显的疗效。并且认为在应用间充质干细胞治疗疾病的同时不需要严格的配型。

人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液(Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stem Cells Injection Against Liver Fibrosis)做为临床治疗肝硬化起到了良好的效果。它作为药物制剂,其主要成分及含量:复方电解质注射液(每1000ml含氯化钠5.26g,葡萄糖酸钠5.02g,醋酸钠3.68g,氯化钾0.37g,氯化镁0.30g),68IU/ml低分子肝素钙,2%人血清白蛋白,脐带间充质干细胞5.0×105个/ml。人脐带间充质干细胞是一种贴壁细胞,在体外的实效性不得超过24小时,否则会严重影响干细胞的活力。但是按照2010年版《中国药典》的附录ⅪH无菌检查法中,干细胞抗肝纤维化注射液作为供试品的无菌检查,按规定的培养基和温度下培养14天,并在培养期间应逐日观察并记录是否有细菌生长。该药典方法检测时间与人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液出厂前无菌检查时间发生了矛盾,所以需要一种3小时内快速有效的检测无菌检查方法。

细菌的16S rDNA中有多个保守区段,为所有细菌所共有,又有分子化石之称。根据这些保守区可以找出细菌通用引物,并且这些引物仅对细菌是特异性的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16SrDNA可变区的差异可以用来区分不同的菌。因此16SrDNA基因已成为较理想的的临床细菌检测靶基因序列,成为细菌鉴别和检测的金标准。

实时荧光定量PCR荧光探针技术的特点有:1.具有高适应性和可靠性,实验结果稳定重复性好,特异性比一般的PCR技术更高。2.适用于样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。3.存在与靶基因同源的序列时,普通PCR容易出现非特异性扩增,实时荧光定量PCR适用于对特异性要求较高的定量检测。4.广泛用于人类传染病的诊断和病原定量,并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成,因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省得多。

本发明采用实时荧光定量PCR荧光探针技术实现了3小时内对常见的细菌快速检测的目的,有效的解决了以往细菌检测滞后的问题。对常见的细菌进行通用的检测,提高了细菌检测的通用性和敏感性。为细胞注射液早期的检测无菌提供了重要依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测干细胞注射液中细菌的方法。

本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌,能够在3小时内完成对常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的检测。

在特定的实施方案中,所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。

本发明的干细胞注射液细菌快速检测方法中,上下游PCR引物及荧光探针序列是从细菌16S rDNA序列的保守区域中筛选得到的通用引物和通用探针(见图1),能够与常见革兰氏阴性细菌和阳性细菌的16S rDNA序列保守区域互补。在优选的实施方案中,上下游PCR引物及荧光探针序列如下:

上游引物序列:5'-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3'(SEQ ID NO:1);

下游引物序列:5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3'(SEQ ID NO:2);

荧光探针序列:(FAM)-5'-CGTATTACCGCGGCTGCTGGCAC-3'-(TAMRA)(SEQ ID NO:3)。

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