[发明专利]一种检测干细胞注射液中细菌的方法

权利要求书

1.一种检测干细胞注射液中细菌的方法，其特征是采用实时荧光定量PCR荧光探针技术检测干细胞注射液中的细菌，上下游PCR引物及荧光探针序列与细菌16S rDNA序列的保守区域互补。

2.根据权利要求1的方法，其能够在3小时内完成对常见的革兰氏阴性细菌和阳性细菌的检测。

3.根据权利要求1的方法，所述干细胞注射液为人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液。

4.根据权利要求1的方法，其中上下游PCR引物及荧光探针序列分别为SEQ ID NO：1、2和3。

5.根据权利要求1-4任一项的方法，其包括以下步骤：

(1)供试品处理：干细胞注射液混匀取1ml转移到1.5ml离心管中，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，各加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做供试品模板；

(2)阳性对照的处理：大肠杆菌经过发酵过夜，用无菌的去离子水稀释大肠杆菌菌液浓度为2 cfu /μl，取其中5μl做阳性对照模板；

(3)阴性对照的处理：取5μl无菌的去离子水做阴性对照模板；

(4)阳性干扰品的处理：干细胞注射液混匀取1ml上清到1.5ml离心管中，同时加入10μl浓度为2 cfu/μl大肠杆菌菌液，4000-6000r/m离心8-12min，取上清到新的离心管中，12000-14800r/m离心5-10min，弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，再次弃上清，加100-1000μl无菌的去离子水重悬，再12000-14800r/m离心5-10min，弃上清加10μl无菌的去离子水重悬，取其中5μl做阳性干扰品模板；

(5)扩增检测：在荧光定量PCR仪上进行，总反应体积为20μl，其中模板5μl，10μM的上下游引物各1μl，2μM的探针1μl，PCR预混液4μl，剩下的用无菌的去离子水补齐；反应条件为：①50℃ 2min；②95℃ 10min预变性；③95℃ 15 sec ，60℃ 1min为一个循环，共40次循环；④40℃ 1 sec；

(6)结果判断：通过比较供试品、阳性对照、阴性对照以及阳性干扰品的Ct值确定供试品中是否含有细菌。

6.根据权利要求5的方法，其中如果阳性干扰品的Ct值和阳性对照的Ct值接近，则说明供试品的处理过程不会导致假阴性的产生。

7.根据权利要求5或6的方法，其中结果判断的标准为：①Ct值≥40.0的标本为阴性；②Ct值≤35.0的标本，检测结果为阳性；③Ct值在35.0-40.0之间为灰色区域，供试品的Ct值≤阳性对照的Ct值，检测结果为阳性；供试品的Ct值≥阴性对照的Ct值，检测结果为阴性。

8.用于权利要求1-7任一项的方法的试剂盒，其包括定量PCR反应液、阴性对照和阳性对照，其中PCR反应液由PCR预混液、细菌检测上游PCR引物、下游PCR引物及荧光探针组成。

9.根据权利要求8的试剂盒，其中上下游PCR引物及荧光探针序列分别为SEQ ID NO：1、2和3。

10.权利要求1-7任一项的方法在干细胞注射液早期无菌检测中的应用。