[发明专利]Celligen310生物反应器制备人二倍体细胞狂犬病疫苗工艺

权利要求书

1.一种狂犬病毒纯化灭活度苗的制备方法，包括如下步骤：采用Celligen310生物反应器培养人二倍体WI-38或MRC-5(以下简称人二倍体细胞)作为为产毒细胞，以狂犬病毒PM株作为毒种，经过接种、培养、收集病毒滤液，再经过浓缩纯化并加入保护液制备得到成品疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述的狂犬病毒PM株为由美国Wistar研究所提供并许可用于生产的，所述的人二培体细胞毒种为通过人二倍体细胞传代适应的狂犬病毒PM株毒种，所述毒种滴度按lgLD₅₀/ml法不低于7.0。

3.根据权利要求1所述的制备方法，所述狂犬病毒纯化灭活度苗的具体培养方法为：

1)将人二倍体细胞在Celligen310生物反应器上培养，使之成为致密的单层细胞，然后接种病毒种子，即狂犬病毒PM株；

2)在33～35℃的适宜温度下培养病毒，到期后，以灌注法多次收获病毒；

3)收获的病毒先利用连续流离心方法去除细胞杂质，再经超滤300KD超滤膜浓缩，然后利用蔗糖密度梯度离心纯化，最后经4FF凝胶柱层析进一步纯化；

4)纯垢的病毒利用β-丙内酯72小时灭活；

5)过滤除菌后即为原液；

6)各项检定合格后，加入保护剂，分装冻干；

7)冻干后制品检定合格后即为成品疫苗；

其中，将所述疫苗按照2010年《中国药典》第三部狂犬病疫苗规程质量标准进行检测，得到的疫苗主要技术指标为：病毒滴度7.0lgLD₅₀/mL；疫苗免疫剂量：0.5mL/人；抗生素残留量：≤50ng/剂；牛血清残留量：50ng/剂；热原：≤50EU；疫苗pH：7.6～7.8；热稳定性符合2010年药典第三部标准，合格；疫苗效力：≥2.5IU/剂；无菌检查：符合2010年药典第三部标准，合格；支原体检查：符合2010年药典第三部标准，合格；异活毒性试验：符合2010年药典第三部标准，合格；鉴别试验：合格。