[发明专利]磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物及用途

说明书

技术领域

本发明属于药物筛选方法领域，涉及应用磁珠分离和液相色谱-质谱联用技术，分析靶标蛋白结合物，尤其涉及枳壳中具有脂肪酶抑制活性的化合物的筛选。 

背景技术

肥胖表现为脂肪细胞中三酰甘油大量堆积，脂肪组织中脂肪细胞增大增多并伴有脂肪分解受损。而脂肪分解调节异常可导致体内的游离脂肪酸浓度增高，从而使肝脏和肌肉中糖类和脂肪代谢紊乱加重，进而导致Ⅱ型糖尿病等慢性疾病的发生。

脂肪酶是催化体内三酰甘油第一步水解的关键酶。食物中的脂肪在脂肪酶的作用下被水解为单酰甘油和游离脂肪酸，在肠道被吸收，然后在体内重新合成脂肪，造成脂肪堆积，最终可导致肥胖。因此，应用脂肪酶抑制剂可有效抑制肠道中脂肪酶对脂肪的分解催化作用，达到减少脂肪吸收、控制和降低血脂的作用。具有脂肪酶抑制活性的化合物常被用于制备减肥及降脂药物，人们已经从天然植物中发现了很多天然的脂肪酶抑制剂。现有的脂肪酶酶抑制剂筛选方法主要采用体外酶活性抑制实验，仅能对纯化合物的活性进行评价，难以用于中药等复杂混合物中脂肪酶抑制剂的发现。

发明内容  

本发明的目的是提供一种磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物的方法，是一种快速发现枳壳中具脂肪酶酶抑制活性的化合物的方法，采用磁珠分离与液相色谱－质谱联用相结合的技术快速发现枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物，并进一步分离获取该化合物。具体通过以下步骤实现。

1. 键合脂肪酶的磁珠制备

（1）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（2）磁珠键合：在活化磁珠上，加入含脂肪酶的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液。再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris) 清洗包被的磁珠4次，弃去清洗液，待用。

2. 键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液（PBS）中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、脂肪酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况。采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况。

3. 筛选具脂肪酶抑制活性的化合物

（1）具潜在脂肪酶抑制活性的化合物初筛：取100 μl枳壳提取物水溶液2份，分别加到180 μl分散于PBS溶液的键合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振荡器上混匀，孵育1 h。弃去上清液，再加入100 μl纯水清洗3次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈水溶液洗脱，吸取洗脱液备用，平行操作三份，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析，记录峰面积；

（2）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有脂肪酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

所述的具脂肪酶抑制活性的化合物经活性验证后确定为柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。

本发明的另一个目的是提供从枳壳中筛选获得的具脂肪酶抑制活性的化合物在制备减肥及降脂药物中的应用。

本发明通过一种快速筛选枳壳中具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，提供一类具有脂肪酶抑制活性的化合物。与传统方法相比，与现有方法相比，能够从混合物中快速筛选并鉴定具有潜在脂肪酶抑制活性的化合物，进一步分离制备该类目标化合物，进行活性验证，大大减少了分离有效成分的盲目性，提高了活性筛选效率。该筛选过程无须制备分离化合物，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。此外，本筛选方法具有快速、准确、重现性好等的特点。可推广用于天然药物或中药混合物中具有脂肪酶抑制活性的化合物的快速筛选。本发明方法获得的具脂肪酶抑制活性的化合物可在制备减肥及降脂药物中应用。 

附图说明

图 1是空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱图，其中1A、1B、1C分别为脂肪酶、空白磁珠以及键合脂肪酶磁珠的红外光谱图。

图 2是脂肪酶键合磁珠洗脱液的液相色谱－质谱联用分析谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例进一步说明本发明的实质内容及有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例所用仪器：