[发明专利]磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物及用途

权利要求书

1.一种磁珠分离筛选具脂肪酶抑制活性化合物的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）键合脂肪酶的磁珠制备：

（a）磁珠活化：取磁珠使用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗后加入1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合均匀，孵育活化30min后移去上清液，并用2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；

（b）磁珠键合：在活化磁珠上，加入含脂肪酶的乙磺酸溶液，震荡混合均匀，在室温孵育30 min进行包被，移去上清液，再用三羟甲基氨基甲烷缓冲液清洗包被的磁珠，弃去清洗液，待用；

（2）键合磁珠质量考察：将制备的键合磁珠分散在磷酸盐缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、脂肪酶键合磁珠的表面分别分析，检查磁珠键合情况；采用傅里叶变换红外光谱仪，测定空白磁珠、脂肪酶、脂肪酶键合磁珠的红外光谱，检查酶结合情况；

（3）筛选具脂肪酶抑制活性的化合物：

（a）具脂肪酶抑制活性化合物的初筛：取100 μl枳壳提取物水溶液2份，分别加到180 μl分散于磷酸盐缓冲液的键合脂肪酶磁珠和空白磁珠中，放在振荡器上混匀，孵育，弃去上清液，再加入纯水清洗3次，弃去清洗液，最后使用含10%乙腈水溶液洗脱，吸取洗脱液备用，取空白磁珠和酶键合磁珠的洗脱液进行液相色谱-质谱联用分析，记录峰面积；

（b）目标化合物获取及活性验证：采用常规柱色谱分离技术分离获取目标化合物群，再采用制备液相色谱分离、纯化目标化合物或购置相对应的目标化合物标准品；采用酶抑制活性实验验证纯化的目标化合物是否具有脂肪酶抑制活性，计算其半数抑制浓度。

2.根据权利要求1所述方法制备的具脂肪酶抑制活性的化合物的方法，其特征在于，所述的具脂肪酶抑制活性的化合物分别是柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷。

3.根据权利要求1所述方法制备的具脂肪酶抑制活性的化合物在制备减肥及降脂药物中的应用。