[发明专利]一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及流感病毒疫苗毒株的制备，具体地说，涉及一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法。

背景技术

流行性感冒（流感）是人类最常见的传染病之一，频繁的区域性暴发与不确定的流感大流行严重危害着人类健康并造成巨大的经济损失。由于流感病毒易发生抗原突变和基因重组，易产生耐药株等特性，因此流感疫苗接种成为控制季节性流感流行和流感大流行所必需的措施之一。

传统的流感疫苗生产大多是在9至12日龄的受精鸡蛋中进行。2007年欧盟批准了诺华公司在哺乳细胞中生产的流感疫苗上市，在哺乳动物细胞中生产流感疫苗比在鸡蛋中生产疫苗具有更大的扩展性，同时可以消除在鸡蛋中生产流感疫苗所引发过敏反应等副作用。然而现阶段，受到生产技术的限制，利用细胞来生产流感疫苗的产率较低，极大限制了流感疫苗的开发和利用，特别影响到流感大流行期应急疫苗的快速生产与接种。

流感病毒（Influenza viruses）是分八节段的单负链RNA病毒，编码12个病毒蛋白，流感病毒是在细胞核中实现病毒基因组的转录(vRNA→mRNA)与复制(vRNA→cRNA→vRNA)，行使转录与复制的最小功能单位是病毒的核衣壳或核糖核蛋白体（ribonucleoprotein，RNP），它是由病毒RNA聚合酶复合体（PB1、PB2、PA）、病毒RNA（vRNA）及多个拷贝的核蛋白（NP）组成的。从流感病毒通过其表面糖蛋白HA与宿主细胞受体结合,经细胞的内吞融合作用脱去病毒的外膜,将病毒vRNPs组释放到细胞胞浆中后开始,vRNPs即在宿主因子（如核转运蛋白）的协助下向核内运输，在核内又在与一系列宿主因子（POLII、转录因子、剪切因子等）的相互作用和博弈下，对病毒RNA进行转录与复制及新生链RNA的剪切加工，然后新生的vRNPs在其它病毒蛋白（NS2、M）和宿主因子（核输出蛋白等）的协助下向核外运输，在胞浆中，病毒mRNA又在宿主因子作用下被优先翻译成蛋白质，其中新合成的某些病毒蛋白，如聚合酶复合体的三个亚单位PB1、PB2、PA及NP各自需要不同宿主因子的协助转运至细胞核中并装配出RNA聚合酶复合体，继续进行病毒基因组的转录与复制。由此可见，流感病毒的转录和复制过程是在与宿主蛋白密切地相互作用下进行的，利用这一特性，开发出新的技术手段来提高流感病毒疫苗毒株在细胞培养生产中的产量。

发明内容

本发明的目的是利用FMRP蛋白在流感病毒转录复制时具有促进RNP装配的特性，提供一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种提高流感病毒疫苗毒株产量的方法，其是通过在用于生产流感疫苗毒株的细胞中过表达FMRP蛋白或含有KH2结构域的功能性截短体蛋白，从而提高流感病毒疫苗毒株在细胞生产中的产量。其中，所述FMRP蛋白的氨基酸序列如Seq IDNo.1所示，编码该蛋白的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。KH2结构域位于FMRP蛋白第280-422位氨基酸上，其氨基酸序列如Seq ID No.3所示。

前述的方法中，所述用于生产流感疫苗毒株的细胞为Vero或MDCK细胞等。

前述的方法中，其是将携带有编码FMRP蛋白的基因或编码含有KH2结构域的功能性截短体蛋白的基因的真核表达载体转入用于生产流感疫苗毒株的细胞中，随宿主细胞的生长复制过表达蛋白（可以是瞬时表达，或通过建立稳定表达的细胞系），然后用流感病毒疫苗毒株感染细胞，培养细胞并收获细胞上清液，从而提高其在细胞生产中的产量。

前述的方法中，所述真核表达载体的出发载体为pCMV6-entry、pcDNA3.1或通过慢病毒载体构建稳定细胞系，如pQCXIP。

前述的方法中，所述真核表达载体为pCMV6-entry-FMRP-myc/flag，购自北京傲锐东源生物科技有限公司（cat.No RC222699）。

通过RNAi筛选技术，发现FMRP蛋白是一种由FMR1基因编码的RNA结合蛋白，定位于细胞浆和细胞核中，可以在流感病毒转录复制的过程中，促进RNP的装配。同时还发现FMRP蛋白的KH2结构域对于流感病毒RNP的装配起到尤为关键的作用。实验表明，通过在用于生产流感疫苗毒株的细胞（如Vero、MDCK细胞）中以瞬时或稳定表达的方式过表达FMRP蛋白可将流感病毒复制效率提高2倍以上，将收获的病毒制备成疫苗，以满足市场对流感疫苗的需求。

附图说明