[发明专利]H5N1亚型禽流感病毒反转录环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及病毒的检测方法和检测试剂盒，特别是涉及H₅N₁亚型禽流感病毒环介导的体外等温扩增检测方法和试剂盒。

背景技术

禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。尤其是高致病力禽流感H₅N₁亚型可导致高达100%的发病率和死亡率，并可直接感染人并致人死亡，其生态学和公共卫生学意义已引起全世界人们的高度重视。H₅N₁亚型禽流感病毒的快速检测是流感防控的重要一环。目前，有关H₅N₁亚型禽流感病毒的检测方法较多，快速、灵敏、特异的分子生物学检测技术已经在禽流感的病毒检测中发挥了重要的作用，但均需要复杂的仪器(如PCR仪)，在一些基层的实验室很难进行操作。如何能够在最先接触疫情的基层实验室，不需要昂贵的仪器即可对H₅N₁亚型禽流感病毒实现快速分子生物学检测，是目前需要解决的迫切问题。

环介导的体外等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年报导的一种新颖核酸扩增技术（Notomi et al.,2000）。该技术针对DNA靶序列的6个区域设计4条特异引物，包含1对内引物和1对外引物，内引物包括前内引物FIP（Forward inner primer）和后内引物BIP（Backward inner primer），外引物包括F3和B3，如图1A所示。FIP由2条引物组成，分别是F1C（靶基因F1序列的互补序列）和F2（与靶序列序列相同），TTTT链接F1C和F2，同理BIP由B1C-TTTTB2构成，TTTT作为连接核苷酸可有可无，当形成的环不够30个核苷酸时，增加4个核苷酸可增加环的长度。外引物B3和F3识别区域位于内引物外侧，分别与靶序列B3C、F3C互补。设计引物时还注意一个原则，扩增区段F2－R2最好控制在200个核苷酸以内。LAMP法扩增的机制（如图1B所示）：1、引物BIP中的B2（B2c的互补序列）与模板DNA中B2c结合，起始互补链的合成；2、B3（B3c的互补序列）与B3c结合，启动链置换反应；3、链置换反应产生1对双链和1条单链，单链两端有互补核苷酸，形成哑铃状；4、引物BIP中的B2与双链茎环结构DNA的环上的B2c合成一种有缺口的过渡性茎环结构DNA；5、在过渡性茎环结构的茎上含有1对反向互补序列，在对面的末端，通过FIP形成1个环状结构;6、在其中加入环引物FLOOP和BLOOP可以大大增加反应效率.在随后的自我引物置换延伸合成过程中，在内引物作用下，开始循环反应，茎的长度和环的个数都逐渐增加，最后的产物为不同长度的茎环DNA组成的混合物。

扩增产物可以通过3种方法来判断：1、琼脂糖凝胶电泳；2、扩增产物中加双链DNA染料PicoGreen；3、肉眼观察扩增负产物焦磷酸镁白色沉淀。LAMP法具有许多其他PCR方法无法比拟的优点。1、只需要保持60℃－65℃的恒定温度就能进行扩增反应，因此无需昂贵的设备，一般的恒温装置如水浴锅或恒温箱就能满足扩增要求；2、针对靶序列的6个区段设计4条引物，扩增的特异性比其他的PCR方法进一步提高；3、整个扩增在1h左右即可完成，且产率可达到0.15mg/mL，扩增效率大大提高。4、进行RT-LAMP时，在增加反转录酶和RNA酶抑制剂后，不需要专门设计反转录的时间，整个反应的时间也不需要增加，进一步提高检测的效率；5、在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物――焦磷酸镁沉淀，由于扩增效率高，产生的焦磷酸镁沉淀多，用肉眼观察或浊度仪检测浊度就能够判断是否扩增。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种H₅N₁亚型禽流感病毒的反转录环介导的体外等温扩增（RT-LAMP）检测方法。

本发明的另一目的在于提供一种H₅N₁亚型禽流感病毒的检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

H₅N₁亚型禽流感病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括一对外引物、一对内引物及一对环引物，