[发明专利]一种检测急性心梗的试纸、试纸制备及应用方法

权利要求书

1.一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、结合垫、层析膜和吸水垫；其中，结合垫包被有葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物；层析膜上具有一条检测带和一条质控带，检测带上固定有单克隆抗体；质控带固定有能与葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物特异结合的兔抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述单克隆抗体为抗肌红蛋白、肌钙蛋白I和肌酸激酶同工酶之一。

3.根据权利要求1所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于:其中所述单克隆抗体的制备步骤为：

（1）使用单克隆抗体免疫抗原免疫小鼠；分别以单克隆抗体抗原与等量弗氏完全佐剂乳化后，采用皮下多点注射方式对4只4周龄的雌性BALB/c小鼠进行皮下免疫；初免后加强免疫数次;

（2）筛选抗单克隆抗体；

A、将1X10⁸脾细胞与2X10⁷骨髓瘤细胞SP2/0混合于50mL融合管中，加DMEM培养基至30mL;1000rpm离心7min，将上清尽量吸净；

B、在手掌上轻击融合管底部，使沉淀细胞松散均匀，置40℃水浴中预热，用1mL吸管在1分钟内加预热至40℃的50%，边加边轻轻摇动混匀,用5mL吸管在90秒内加25mL预热至37℃的不完全DMEM培养基，室温静置10min，800rpm离心7分钟，弃上清；

C、加入5Ml HAT完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至90mL,分装至融合前一天培养的含有饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；培养板置37℃ 5%CO2培养箱内培养；

D、培养至第5天，用HT完全培养基换出孔内1/2HAT培养液,培养至第7天，用HT培养基换出孔内全部培养液；

E、每天观察杂交瘤细胞生长情况,待杂交瘤细胞长至10%以上孔底面积时，吸出培养液，进行抗体检测；用竞争抑制ELISA方法，筛选出分泌抗细菌脂多糖和脂溶性蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞;

（3）腹水生产，选用标准BALB/c小鼠，先用降植烷进行小鼠腹腔注射，一周后每只老鼠按照5X10⁶杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去;1周后采集腹水，将腹水置于37℃静置2小时后，13000rpm离心10min，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，再过玻璃纤维柱，收集到澄清的腹水;

（4）抗体纯化，采用辛酸-硫酸铵法进行初步纯化，取1mL透析后粗提物加入1mL预装柱，用pH=7.4的PBS进行洗涤，加入pH=2.7的1mL的100mM甘氨酸进行洗脱，重复6次;收集流出液，1mL/管，并用50μl 1M Tris中和反应。

4.根据权利要求1所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述的兔抗鼠IgG抗体的制备步骤为：

（1）用含鼠IgG的免疫原多次免疫家兔；

（2）收集、分离得到含有兔抗鼠IgG抗体的血清；

（3）将抗体血清加入到亲和层析柱中纯化得到兔抗鼠IgG抗体。

5.根据权利要求1所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述的葡聚糖-抗体-荧光素混合标记物制备步骤为：

（1）将荧光素分子与以亲水链为骨架的葡聚糖分子反应，得到结合荧光素的葡聚糖分子；

（2）将结合荧光素的葡聚糖分子与抗体反应，纯化，得到葡聚糖、抗体和荧光素混合标记物。

6.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述的葡聚糖优选为分子量20,000～30,000的葡聚糖。

7.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述的荧光素优选为异硫氰酸荧光素。

8.根据权利要求5所述的一种检测急性心梗的试纸，其特征在于：所述的纯化优选通过凝胶层析法进行分离纯化。