[发明专利]基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置

说明书

技术领域

本发明涉及显微镜领域，尤其涉及一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法和装置。

背景技术

与绝大部分光学成像一样，自从显微镜被发明以来，阿贝衍射极限也一直制约着显微系统分辨率的提高。早期的显微系统均为宽场成像系统，成像分辨能力有限。这一情况直到共聚焦显微系统(Confocal Microscope)发明后才得到一定的改善。

共聚焦显微的基本概念在1957年由M.Minsky等人提出【M.Minsky等Microscopy Apparatus，美国专利3013467】，但直到1978年该技术才真正得以仪器化【C.Cremer等Considerations on a laser-scanning-microscope with high resolution and depth of field】。

激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

与传统的宽场显微系统相比，共聚焦显微系统采用扫描成像的方式，在与成像物面共轭的焦平面上放置一个针孔(Pinhole)对非成像点周围的杂散光进行遮挡，从而有效地限制了系统的有效点扩散函数。通过系统的光学传递函数分析可以证明，使用共聚焦方法，能够在系统的极限分辨率提高约1.4倍。

一般而言，常规的光束通过显微物镜聚焦后，将在焦平面上产生一个有限尺度的实心聚焦光斑，而聚焦光斑的大小将直接决定共聚集显微系统的分辨能力。受制于工作波长、数值孔径等因素的限制，共聚焦显微系统的极限分辨能力一般不超过150纳米。

发明内容

本发明提供了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，以进一步改善共聚焦显微系统的分辨能力。

一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微方法，包括以下步骤：

1)激光光束经位相编码后转换为圆偏振光；

2)将所述圆偏振光通过显微物镜聚焦到待测样品上形成聚焦光斑并激发荧光；

3)对所述待测样品的表面进行扫描并收集激发荧光，获取不同位置的光强度信息，并计算得到相应的显微图像。

作为优选，所述步骤1)中的位相编码为0～2π涡旋位相编码。

0～2π涡旋位相编码是指对于一个横截面中心对称的圆形入射光束，以光束中心点为圆心，对横截面内的光束产生0～2π的涡旋位相延迟，位相延迟量仅与截面内特定点的角向大小有关，而与该点到到圆心的距离无关。可用如下公式加以表示：

其中Δα为位相延迟量，为角向大小。

作为优选，所述显微物镜的数值孔径NA＝0.95～1.4。

作为优选，对所述步骤3)的光强度信息进行反卷积运算。反卷积运算是指信号处理中通过测量输出和已知输入重构未知输入的过程，可选用的具体运算方法包括Bussgang算法、似然估计算法、状态空间模型法等。

作为优选，所述显微物镜的数值孔径NA＝1.4。

本发明还提供了一种基于空心聚焦光斑激发的共聚焦显微装置，包括激光器和放置待测样品的样品台，沿所述激光器的光路依次布置的位相编码器、偏振态转换器和用于将光束聚焦到所述待测样品上的显微物镜，所述待测样品发出的激发荧光被显微物镜收集；并设有探测所述显微物镜收集的激发荧光的光强度信息的探测成像系统。

其中，所述的激光器为能发射波长为380～780nm内任意波长的可见单色光的激光器，优选波长由所观察荧光样品的荧光吸收与发射光谱决定。激光器出射偏振态为线偏振，且为准直光。

其中，所述的位相编码器在现有技术条件下可以有多种选择，如位相板(Phase Plate，PP)、空间光调制器(Spatial Light Modulator，SLM)等，优选为位相板。

所述探测成像系统包括：

用于将所述显微物镜收集的激发荧光进行聚焦的凸透镜；

位于所述激发荧光聚焦的焦点处并用于遮挡理想焦点外荧光散射噪声的针孔；

用于感应穿过所述针孔光强度信号的光电感应器件；

用于集成控制并进行反卷积运算的计算机。