[发明专利]拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶及应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-酰胺酶及其编码基因在手性化合物上的应用。

背景技术

（-）2-氮杂双环[2,2,1]庚-5-烯-3-酮（简称（-）γ-内酰胺）是合成抗病毒药物如阿巴卡韦的重要中间体，获得高光学纯度的（+/-）γ-内酰胺是限制上述多种抗病毒药物、及代谢调节药物生产成本降低、及产量提高的主要因素之一。目前，γ-内酰胺酶是一种新型的酰胺酶，能够催化酰胺类化合物的酰胺键水解。(+)γ-内酰胺酶能够高效拆分外消旋体γ-内酰胺，获得光学纯的(-)γ-内酰胺。光学纯的(-)γ-内酰胺是制备抗病毒药物阿巴卡韦((-)abacavir)的重要中间原料，具有巨大的经济价值。与化学合成法相比，生物催化具有的反应条件温和，特异性高，低能耗，底物专一性，重复使用，催化效率高等优点,已代替某些化学合成法投入应用；微生物酶法拆分外消旋体γ-内酰胺具有良好的应用前景。

中国专利申请“一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用”（申请号：201010210197.3，公开号：CN101921742A）中公开一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用，其是来源于氧化烃微杆菌的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因，还提供了该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺的应用。利用该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺可以获得光学纯度为99.5％的(-)γ-内酰胺，收率大于39％。

但是，目前的科研和实践中，尚未将大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）体内的（+）γ-酰胺酶及其编码基因克隆和表达并应用于获得高纯度（-）γ-内酰胺。

发明内容

本发明提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-酰胺酶及其编码基因在手性化合物上的应用；以及利用一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶，所述的（+）γ-内酰胺酶是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:1；

（b）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID No:1衍生的蛋白质。

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶编码基因，所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因是如下（a）或（b）的基因：

（a）、其核苷酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:2；

（b）、编码序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。

一种重组表达载体、一种转基因细胞系、一种宿主菌，均含所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达，制备得到（+）γ内酰胺酶的方法；以及所述的（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用方法。

所述的（+）γ-内酰胺酶（BJA）基因的克隆和表达方法为：提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；

所述的（+）γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用为：

将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体或（+）γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。

本发明的目的是通过以下另一技术方案实现的：

一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；

B、振荡培养：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液；