[发明专利]拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶及应用

权利要求书

1.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶，其特征在于：

所述的（+）γ-内酰胺酶是如下（a）或（b）的蛋白质：

（a）其氨基酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:1；

（b）将序列表中的SEQ ID No:1的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、和/或缺失、和/或添加，且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID No:1衍生的蛋白质。

2.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶编码基因，其特征在于：

所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因是如下（a）或（b）的基因：

（a）、其核苷酸序列组成为：序列表中的SEQ ID No:2；

（b）、编码序列表中的SEQ ID No:2的氨基酸序列的核苷酸序列。

3.一种重组表达载体，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。

4.一种转基因细胞系，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶编码基因。

5.一种宿主菌，其特征在于：含有权利要求2中所述的（+）γ-内酰胺酶的编码基因。

6.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于：

提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；

将所述的用于提取重组蛋白的重组菌体悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。

7.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的（+）γ-内酰胺酶的编码基因的应用，其特征在于：

提取大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum，CGMCC：1.2550）基因组DNA，构建用于提取重组蛋白的重组菌体，再通过表达得到所述的（+）γ内酰胺酶；

将所述的（+）γ内酰胺酶悬浮在的磷酸缓冲液中，加入γ内酰胺底物，37℃反应24小时，得到反应混合物；将所述的反应混合物进行离心处理，保留上清液；将所述的上清液中加入乙酸乙酯萃取，进行HPLC检测，获得（-）γ-内酰胺。

8.一种以大豆慢生根瘤菌为菌种生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

A、菌种选择：选用大豆慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）作为菌种，菌种保藏号为CGMCC No.1.2550；

B、振荡培养：将所述的大豆慢生根瘤菌菌种接种到根瘤菌培养基中，进行振荡培养，得到发酵液；

C、收集菌体：将所述的发酵液与pH值为7.0的磷酸盐缓冲液的混合，得到稀释发酵液；将所述的稀释发酵液进行离心处理，收集沉淀；将该沉淀用所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液进行洗涤处理，回收得到湿菌体；

D、生物拆分实验：将所述的湿菌体与(+/-)γ-内酰胺溶液混合，得到菌体混合液；将所述的菌体混合液进行振荡培养，得到振荡后的菌液；

E、分离样品：将所述的振荡后的菌液以进行离心处理，得到上清液，即为所述的（-）γ-内酰胺。

9.根据权利要求8所述的生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：所述的根瘤菌培养基的碳源包括葡萄糖、甘露醇、蔗糖中的一种或几种的混合物；所述的根瘤菌培养基的氮源包括胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、玉米浆中的一种或几种的混合物。

10.根据权利要求8所述的生产（-）γ-内酰胺的方法，其特征在于：所述的pH值为7.0的磷酸盐缓冲液由0.05mol/l的Na₂HPO₄溶液和0.05mol/l的NaH₂PO₄溶液混合而成，所述的Na₂HPO₄溶液和NaH₂PO₄溶液的体积比为7:3。