[发明专利]一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。

背景技术

杨树属于杨柳科(Salicaceae)杨属(Populus L.)，属下共分白杨派、大叶杨派、青杨派、黑杨派、胡杨派5派。全世界约有杨树百余种，其自然分布主要是在北半球的温带和寒带。我国有杨树53种，主要分布在西南，西北，东北及华北地区。杨树基因组较小（约为450～550Mbp）,仅为拟南芥基因组的4倍，易于农杆菌介导遗传转化，种间可杂交，被认为是林木生物技术的模式树种。

杨属白杨派又分两个亚派：白杨亚派和山杨亚派。白杨亚派包括新疆杨（P.bolleana）（银白杨变种）、银灰杨（P.canescens）、毛白杨（P.tomentosa）；山杨亚派包括欧洲山杨（P.tremula L）、美洲山杨（P.tremuloides）、中国山杨（P.devidiana）和响叶杨（P.adenopoda）；欧美杂种山杨是欧洲山杨和北美山杨的杂交种，具有生长快、树形高大、材性好等特点；另外该树种材色浅，材质较软、细密、树干端直，是造纸、制备胶合板和刨花板等的优质原料。

但是杨树属于多年生树种，要在短时间内通过常规育种培育出杨树新品种是很困难的，且通过传统的杨树育种方法己远远不能满足现代育种的要求，所以利用组织培养技术和基因工程方法来培育抗逆杨树新品种对杨树育种具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，包括如下步骤：

（1）预培养：

欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22-24℃、80-100rpm暗培养1-2d；

（2）农杆菌的培养：

①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28℃划线暗培养2-3d；

②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB液体培养基中于28℃、150-200rpm暗培养24h，至OD₆₀₀为0.6-0.8；

③将步骤②获得的菌液在3000-4000rpm离心8-10min，弃去上清液，用含有100μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD₆₀₀为0.4-0.5，于28℃、80-100rpm继续培养0.5-1h，得到侵染液；

（3）共培养与芽的诱导：

①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22-24℃、80-100rpm培养0.5-2h，转移至含有100μΜ乙酰丁香酮的MS1固体培养基上，于22-24℃黑暗共培养2d；

②将共培养后的外植体用灭菌的300-400mg/L头孢霉素水溶液清洗2-3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS1固体培养基在22-24℃，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为400-600lux，16h/d；在第8天开始，光照强度为1500-2000lux，16h/d，每14d更换一次培养基；

（4）芽的伸长：

将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm；

（5）根的诱导：

将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。

步骤（1）中所述1/2MS培养基包括：MS盐2.2g/L，蔗糖25-30g/L，pH=5.6-5.8，琼脂7.0-7.2g/L。

步骤（1）中所述MS液体培养基包括：MS盐4.4g/L，蔗糖25-30g/L，生长素NAA1.86mg/L，细胞分裂素2ip1.02mg/L，pH=5.6-5.8。

步骤（2）中所述YEB固体培养基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O0.5g/L，琼脂15g/L，pH=7.0。