[发明专利]一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法

权利要求书

1.一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征是包括如下步骤：

（1）预培养：

欧美杂种山杨在1/2MS培养基上继代繁殖得到组培苗；选取生长状态良好的组培苗上带有部分叶片的叶柄作为外植体，将所述外植体置于MS液体培养基中于22-24℃、80-100rpm暗培养1-2d；

（2）农杆菌的培养：

①携带双元载体pMP90、pBI121的农杆菌C58在含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的YEB固体培养基上于28℃划线暗培养2-3d；

②挑单菌落接种到含有30mg/L庆大霉素、50mg/L利福平、50mg/L卡那霉素的60-75mlYEB液体培养基中于28℃、150-200rpm暗培养24h，至OD₆₀₀为0.6-0.8；

③将步骤②获得的菌液在3000-4000rpm离心8-10min，弃去上清液，用含有100μΜ乙酰丁香酮的MS液体培养基重悬菌体至OD₆₀₀为0.4-0.5，于28℃、80-100rpm继续培养0.5-1h，得到侵染液；

（3）共培养与芽的诱导：

①将预培养后的外植体浸于侵染液中，于22-24℃、80-100rpm培养0.5-2h，转移至含有100μΜ乙酰丁香酮的MS1固体培养基上，于22-24℃黑暗共培养2d；

②将共培养后的外植体用灭菌的300-400mg/L头孢霉素水溶液清洗2-3次，再置于含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS1固体培养基在22-24℃，培养至长出不定芽，在第1-7天，光照强度为400-600lux，16h/d；在第8天开始，光照强度为1500-2000lux，16h/d，每14d更换一次培养基；

（4）芽的伸长：

将带有不定芽的外植体转至含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的MS2固体培养基上诱导芽伸长至3-5cm；

（5）根的诱导：

将伸长的芽转入含有350mg/L头孢霉素、50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上诱导生根。

2.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（1）中所述1/2MS培养基包括：MS盐2.2g/L，蔗糖25-30g/L，pH=5.6-5.8，琼脂7.0-7.2g/L。

3.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（1）中所述MS液体培养基包括：MS盐4.4g/L，蔗糖25-30g/L，生长素NAA1.86mg/L，细胞分裂素2ip 1.02mg/L，pH=5.6-5.8。

4.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（2）中所述YEB固体培养基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，琼脂15g/L，pH=7.0。

5.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（2）中所述YEB液体培养基包括：牛肉浸膏5.0g/L，胰蛋白胨5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，蔗糖5.0g/L，MgSO₄.7H₂O 0.5g/L，pH=7.0。

6.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（3）中所述MS1固体培养基包括：MS盐4.4g/L，蔗糖20-30g/L，生长素IBA 0.1mg/L，细胞分裂素BAP 0.2mg/L，细胞分裂素TDZ 0.001mg/L pH=5.6-5.8，琼脂7.0-7.2g/L。

7.根据权利要求1所述的一种欧美杂种山杨的农杆菌介导转基因方法，其特征在于步骤（4）中所述MS2固体培养基包括：MS盐4.4g/L，蔗糖20-30g/L，生长素IBA 0.1mg/L，细胞分裂素BAP 0.2mg/L，pH=5.6-5.8，琼脂7.0-7.2g/L。