[发明专利]短小芽孢杆菌LD-b1的发酵工艺及其在防治植物病害中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株防治植物病害的生防菌株，包括其发酵生产工艺及其在植物病害生物防治中的应用，属于生物农药技术领域。 

背景技术

自1898年Vogl从黑麦草种子中分离出第一株内生菌至今，内生菌的研究已经有100多年的历史。近年来的研究表明，几乎所有植物都存在内生菌，它们生长在植物表皮下的组织中，主要包括细菌、真菌和放线菌等。据Dreyfuss和Chapela估计，至少有数十万种内生菌存活于维管植物细胞内或细胞间隙的特殊环境中。我国的植物资源极其丰富，但由于近年来开荒、放牧、造林、采挖等诸多原因，很多野生植物资源遭受严重破坏。云雾龙胆是龙胆科龙胆属多年生宿根草木植物，主治胃炎、气管炎、尿道炎、天花及痘疹，是龙胆属植物中少数未被系统研究过的珍贵药材，被国家列为重点保护品种。对云雾龙胆内生菌的分离和研发有利于保护濒危植物内生菌，并开发植物病害生物防治新的菌种资源。 

植物病害是影响农业生产的主要因素之一，目前的防治以使用化学农药为主，容易诱导病菌产生抗药性；而且化学杀菌剂污染环境，破坏农田中微生物菌群的生态平衡，残留的农药不仅影响农产品质量，而且危害人类健康。植物病害的生物防治方法安全有效，越来越引起人们的关注。但从土壤和植物根际分离筛选到的植物病害生防菌在植物体内定植困难，在与病害菌的竞争中难以占据优势。植物内生细菌占据有利生态位、不易受环境条件影响、容易定植于植物体中，能抗病原菌入侵，在植物病害生物防治中具有显著的优势。芽孢杆菌是常见的内生细菌种类，可以产生杆菌肽、环脂、氨基酸类、核酸类、类噬菌体颗粒等多种抗菌物质，能抑制多种植物病原菌；而且芽孢杆菌具有生长快、营养简单、抗逆性强等优点，非常适合开发成生防菌剂。 

发明内容

本发明的目的是提供具有防治植物病害作用的一株短小芽孢杆菌菌株，发酵制备出高效的生防菌剂，能更好地防治农田植物病害，减少化学农药对环境的污染。 

本发明是从云雾龙胆的茎中分离筛选到一株具有广谱抗植物病害真菌活性的细菌，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，菌株代号为LD-b1。其生物学特征为：革兰氏阳性，菌体细胞大小0.5μm～0.6μm×1.5μm～2.1μm；接触酶、柠檬酸盐利用、酪蛋 白水解、七叶苷水解、V.P为阳性；氧化酶、脲酶、H2S产生、吲哚产生、硝酸盐还原、明胶液化、精氨酸双水解酶、淀粉水解、M.R.为阴性；能够利用的碳源有：葡萄糖、蔗糖、乳糖、树胶醛糖、木糖、半乳糖、甘露醇、N-乙酰-葡糖胺、葡糖酸盐；不能利用淀粉、糊精、蜜二糖、鼠李糖和山梨醇。菌株LD-b1现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2012年5月14日，保藏号为CGMCC No.6112。 

本发明所述生防菌株LD-b1的发酵生产工艺流程为：斜面菌种→摇瓶菌种→种子罐→生产罐→产品。 

本发明中生防菌株LD-b1发酵生产的详细步骤为： 

将保藏菌种划线接种于固体斜面培养基上，培养基配方(g/L)为：蔗糖10，蛋白胨2，牛肉膏3，酵母膏0.5，琼脂15，pH7.5；30℃培养36～48h，形成菌苔。 

用5mL无菌水将活化菌种从试管斜面上洗下，接入种子培养基中，培养基配方(g/L)为：蔗糖15，蛋白胨5，酵母粉0.2，磷酸氢二钾0.5，硫酸镁0.05，氯化钠0.1，pH7.5；250mL三角瓶装100mL的液体种子培养基，接种后的三角瓶置于旋转式摇床上，150r/min、30℃培养24～30h制成摇瓶种子液。 

种子罐的培养基与摇瓶种子的培养基相同，发酵条件为：装液量70％，接种量5％，发酵温度30℃，通气量1∶1，罐压0.2kg/cm²，搅拌转速200～600r/min，溶氧10％以上，发酵时间24小时，菌量可达10⁸cfu/mL。 

生产罐的培养基配方(g/L)为：蔗糖25，豆饼粉3，硫酸铵2.5，酵母粉0.2，磷酸氢二铵0.8，硫酸镁0.05，硫酸亚铁0.02，氯化钠0.1，pH7.5；发酵条件为：装液量70％，接种量5％，发酵温度30℃，通气量1∶1，罐压0.2kg/cm²，搅拌转速100～300r/min，溶氧5％以上，发酵30小时和45小时分别补加10g/L蔗糖两次，发酵时间68小时，菌量可达10¹⁰cfu/mL。 

本发明中菌株LD-b1对植物病害真菌的生物防治效果