[发明专利]利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因工程技术领域，尤其涉及的是一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质（含蛋氨酸和半胱氨酸）新种质的方法。

背景技术

含硫氨基酸在饲料植物中含量较少，特别是半胱氨酸和蛋氨酸，常成为第一限制性必需氨基酸。培育高含硫氨基酸的饲草品种是当前饲草品质改良的研究热点之一。菊苣（Cichorium intybus L.）是菊科菊苣属多年生草本植物，适应性强，喜温暖湿润气候，温度达５℃时，能正常生长发育。抗寒能力强，幼苗能耐-8℃的低温。对土壤要求不严格，在荒地、坡地均能生长，全国各地都适合种植。利用期长，由于春季返青早，冬季休眠晚，利用期长达8个月（4～11月）之久，夏秋干旱季节，大多数牧草枯黄时，菊苣仍能保持青枝绿叶，可解决养殖业春秋两季和青饲料紧缺的矛盾，一次播种，在不收种的情况下可连续利用多年。菊苣被广泛用于饲料、蔬菜、制药和制糖原料，是目前较具开发前途的经济作物和首选的养殖业青饲料，近年来，菊苣在很多地区大量栽培，己成为一种极受欢迎的高档保健型蔬菜和新型优良饲草。但是菊苣含硫氨基酸特别是蛋氨酸和半胱氨酸含量很低，限制了其更为广泛的利用。菊苣遗传背景复杂，用常规育种方法培育高蛋白和高含硫氨基酸品种不仅耗时耗财耗力且难度极大，因此，利用一些高含硫氨基酸蛋白基因，通过遗传工程手段创造菊苣优质新种质，并提高菊苣蛋白质中含硫氨基酸水平具有十分重要的意义。利用转基因技术改良菊苣品质特别是提高含硫氨基酸含量目前还没有报道。

重组蛋白基因zeolin是将菜豆球蛋白基因phaseiolin 通过连接肽连接到玉米种子醇溶蛋白基因γ-Zein的N端构成的,该基因富含蛋氨酸和半胱氨酸，为提高了转基因植物中zeolin基因的稳定性和增强其表达，在重组基因前面加上了内质网驻留蛋白信号（KDEL）。Zeolin重组蛋白基因编码区有1578个核苷酸，编码526个氨基酸序列。其蛋白质分子量为58.0kDa。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法。

本发明的技术方案如下：

一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，包括以下步骤：A1、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；

A3、转化菌液的准备：用无菌牙签或接种针挑取含有外源基因质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种到50 mL 含有硫酸链霉素(Str, 50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液体YMB培养基中，28℃振荡培养16～24h至对数生长期，将培养物于4000~5000 r/min 离心10 min ，去除上清液，收集菌体，用1/2MS无菌液体培养基重悬沉淀至OD600=0.4Abs，用于侵染转化；或直接用1/2MS无菌液体培养基稀释菌液用于侵染。所述YMB培养基：0.5g/L K₂HPO₄＋0.2g/L MgSO₄·7H₂O＋0.5g/L NaCl＋10g/LMannitol ＋0.4g/LYeast extract，pH7.5；

A4、外源基因的浸染转化：无菌条件下，选取生长状态良好的预培养外植体放入制备好的菌液中，使叶片外植体与菌液充分接触，并放于震荡培养箱上震荡浸染10min；浸染完后取出外植体，用灭菌滤纸吸去叶片表面附着的多余菌液，接种到垫有一层无菌滤纸且添加有乙酰丁香酮（AS，100umol/L）的共培养基上，于黑暗中共培养2-3d到肉眼有可见微菌落；共培养完后，将外植体接种到与预培养相同的培养基上进行恢复培养1-2d；所述共培养培养基为：MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L+AS 100μmol/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.4～5.8；

A5、抗性芽筛选和再生：恢复培养后，将转化外植体转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，25mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，500 mg/L）的筛选培养基中筛选培养直到长出抗性芽，当抗性芽长到1cm时，转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，15mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的扩繁培养基中扩繁至芽长到2-3cm，再转入含筛选剂潮霉素（Hyg，10mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的生根培养基中进行生根培养，直到长成完整的小植株；