[发明专利]利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法

权利要求书

1.一种利用植物基因工程技术培育菊苣优质新种质的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、菊苣无菌实生苗的获得；A2、叶片外植体预培养；

A3、转化菌液的准备：用无菌牙签或接种针挑取含有外源基因质粒的农杆菌LBA4404单菌落，接种到50 mL 含有硫酸链霉素(Str, 50 mg/L)和卡那霉素(Kan, 50 mg/L)的液体YMB培养基中，28℃振荡培养16～24h至对数生长期，将培养物于4000~5000 r/min 离心10 min ，去除上清液，收集菌体，用1/2MS无菌液体培养基重悬沉淀至OD600=0.4Abs，用于侵染转化；或直接用1/2MS无菌液体培养基稀释菌液用于侵染；所述YMB培养基：0.5g/L K₂HPO₄＋0.2g/L MgSO₄·7H₂O＋0.5g/L NaCl＋10g/LMannitol ＋0.4g/LYeast extract，pH7.5；

A4、外源基因的浸染转化：无菌条件下，选取生长状态良好的预培养外植体放入制备好的菌液中，使叶片外植体与菌液充分接触，并放于震荡培养箱上震荡浸染10min；浸染完后取出外植体，用灭菌滤纸吸去叶片表面附着的多余菌液，接种到垫有一层无菌滤纸且添加有乙酰丁香酮（AS，100umol/L）的共培养基上，于黑暗中共培养2-3d到肉眼有可见微菌落；共培养完后，将外植体接种到与预培养相同的培养基上进行恢复培养1-2d；所述共培养培养基为：MS基本培养基+6-BA 2.0mg/L＋IBA 0.2mg/L+AS 100μmol/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH5.4～5.8；

A5、抗性芽筛选和再生：恢复培养后，将转化外植体转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，25mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，500 mg/L）的筛选培养基中筛选培养直到长出抗性芽，当抗性芽长到1cm时，转入含筛选剂潮霉素（ Hyg，15mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的扩繁培养基中扩繁至芽长到2-3cm，再转入含筛选剂潮霉素（Hyg，10mg/L）和抑菌剂头孢霉素（Cef，250 mg/L）的生根培养基中进行生根培养，直到长成完整的小植株；

所述筛选培养基为：MS基本培养基+2.0mg/L6-BA ＋0.2mg/LIBA+0.01mg/L TDZ+25mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH5.8～6.0；

扩繁培养基：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA＋0.2mg/LIBA+0.01mg/L TDZ+15mg/L Hyg+500 mg/L Cef+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；pH5.8～6.0；

生根培养基为：1/2MS基本培养基+0.1mg/LNAA+10mg/L Hyg+250 mg/L Cef+蔗糖15g/L+8g/L琼脂，pH5.8-6.0；

A6、菊苣优质种质材料的鉴定和筛选。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A1中，挑选饱满的菊苣种子，依次进行75 %的乙醇表面浸泡30s，升汞浸泡10分钟，期间不停摇动，倒掉升汞，无菌水反复冲洗，最后用无菌水浸泡种子12h，倒掉浸泡液，用无菌滤纸吸干表面水分，接种于装有高压灭菌的Ms培养基的三角瓶中上，放于温室中萌发，得到无菌实生苗；所述无菌实生苗培养基为：MS基本培养基+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A2中，选取菊苣无菌苗幼嫩叶片，切成0.5×0.5cm小块，将其接种于诱导培养基中进行预培养2-3d，培养到叶片边缘开始膨大；所述诱导培养基为：MS基础培养基+6-BA 2.0mg/L+IBA 0.2mg/L+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH为5.8-6.0。