[发明专利]基于上转换荧光纳米颗粒标记的定量检测克伦特罗的免疫层析试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种以上转换荧光材料作为生物标记物的用于定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术   

克伦特罗（Clenbuterol，CL），俗称“瘦肉精”，盐酸克伦特罗是其盐酸盐，具有促进肌肉发育和脂肪分解作用，克伦特罗可以提高肉用动物的胴体瘦肉率。因为消费者对瘦肉的特殊偏好，瘦肉产出率高的猪可以卖个好价钱，添加“瘦肉精”给养殖户带来了额外收益。因此，受不法利益的驱使，养殖户常在养殖环节添加“瘦肉精”到动物饲料中去。

但是克伦特罗是一种选择性β₂-肾上腺素受体激动剂，副作用极大，当摄入量较大时会造成心血管系统的损害和严重的神经症状。当人们食用了含克伦特罗残留的动物内脏和肉品后，会造成急性或慢性食肉中毒，危害消费者的健康。目前为止没有一个国家批准“克伦特罗”可用于动物生产中，但长期以来一直存在着非法使用的情况，在世界各地造成严重食物中毒的事件并不鲜见。近年来在我国多个城市也出现了“瘦肉精”中毒事件，极大地威胁着消费者的身心健康。 

用于克伦特罗残留检测的方法较多，主要有（1）理化分析法，如高压液相色谱仪、气相色谱、薄层层析、电泳法等；（2）免疫分析法，如放射免疫法、酶联免疫吸附法等；（3）生物测定法，如微生物学测定法、放射受体测定法等。但这些方法需要昂贵的仪器设备，需要熟练的专业人员操作，操作过程复杂，检测时间较长，限制了其应用范围，难以在实际生产中推广应用。

免疫试纸法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待测物的初步信息，该法灵敏度高，分析过程简单，用作“瘦肉精”的筛查有独特优势，是需要优先发展的检测技术。上转换荧光技术(UPT)，是一种具有高灵敏度、基于上转磷光体(UCP)的新型生物检测技术，UCP具有独特的物理结构和光学特性，是一种完全惰性的无机发光材料，经过表面修饰与活化后，可作为新型标记物在生物检测领域应用。经检索，用于检测食品中农药、兽药残留的UCP免疫层析试纸未见报道，虽然胶体金试纸在此方面应用较广，但其不能做到定量检测，作为更敏感、稳定、灵活、安全的UPT-LF的研究，是胶体金免疫检测技术的有力补充，亟待加强该方面的研究和探讨。

发明内容

本发明要解决的技术问题：针对现有技术存在的不足，提供一种特异、灵敏、快速、简便、能定量检测克伦特罗残留的免疫层析试纸条及其制备方法。

本发明的技术方案：

一种基于上转换荧光纳米颗粒标记的检测克伦特罗的免疫层析试纸条，底层为支撑层，中间层为吸附层，保护层固定在吸附层上，吸附层从测试端依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层，在纤维素膜层上设有用偶联CL的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹，还设有用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体采用NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体。 

所述NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒是以NaYF₄为基质、Yb³⁺为敏化剂，由Yb和Er共掺杂形成的直径为50-200nm的纳米颗粒。

所述NaYF₄:Yb:Er纳米颗粒标记的CL单克隆抗体或多克隆抗体由以下方法制备，具体步骤为：

（1）荧光纳米颗粒的表面硅化

将NaYF₄:Yb:Er荧光纳米颗粒分散在质量浓度为10%的乙醇溶液中，在搅拌下加入5ml浓氨水，反应10min，然后加入2ml正硅酸四乙酯，室温反应3h；6000rpm离心5min，水洗后用乙醇分散；

（2）荧光纳米颗粒的表面氨基化

将表面硅化的荧光纳米颗粒加入体积比为3:5的甲醇、丙酮的混合溶液中，经超声波分散，加入5μl的N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，70℃水浴反应1h，6000rpm离心5min，将得到的沉淀用乙醇洗涤，干燥；

（3）CL抗体的标记