[发明专利]一种放射形土壤杆菌突变株及其制备β-1,3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及到一种放射形土壤杆菌突变株及其制备β-1,3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法。 

背景技术

β-1,3葡聚糖普遍存在于多种细菌、真菌、植物和酵母细胞壁中。上世纪北欧芬兰等国科学家，已实验证明β-1,3葡聚糖能提高鱼虾抗病免疫力，其原理是：鱼虾的巨噬细胞上有一种高度专一性的受体，这种受体能对β-1,3葡聚糖特殊的分子结构进行高度转移的结合，从而活化巨噬细胞，增强其吞噬各种病菌、病毒的能力。此外，β-1,3葡聚糖还能和甲壳类动物（如虾等）血液中的一种专一性蛋白质反应，并与淋巴细胞上的专一受体结合，诱导颗粒性血淋巴细胞中的酚氧化酶释放，酶原经过β-1,3葡聚糖催化成具有活性的酚氧化酶，这种酚氧化酶迅速将酚氧化成醌，而醌类的高反应活性可以杀死微生物（含病毒），从而达到抗原免疫的效果，而β-1,4或β-1,6葡聚糖，则不具有上述的特殊功能。 

我国九十年代初，已成功从啤酒酵母细胞壁中提取β-1,3葡聚糖。目前查到的相关专利文献有： 

1.专利申请号2004100461741.3，公开了一种提取β-1,3-葡聚糖的方法，包括如下步骤：1）碱处理：向酵母细胞壁中加入NaOH反应，过滤收集沉淀物；2）酸处理：向沉淀物中加入酸溶液反应，调节pH到4.5，升温，过滤收集沉淀物：3）有机溶剂浸提，冷冻干燥后即得。该发明制备工艺简单，工艺参数易于控制，产物β-1,3葡聚糖的得率和纯度都比较高。所得产物能显著提高肉仔鸡的生长和免疫功能，可广泛用于畜禽养殖业，调节畜禽的免疫机能。 

2.专利号200810153337.0，公开了一种快速制备酵母β-1,3-葡聚糖的方法，是以酵母细胞或酵母细胞壁为原料，加入浓度为0.5-1.5M的NaOH溶液，放入高压锅中在0.070-0.140MPa下处理0.3-1h后，冷却至室温，离心，用水稀释剩余的不溶物，离心，水洗；向沉淀物中加入体积浓度为1%-6%的冰乙酸溶液，升温到70-90℃，反应0.5-1h后，离心收集沉淀物，水洗，剩余物用乙醇洗涤，抽滤；在干燥箱中干燥即可制得。用该方法制备酵母β-1,3葡聚糖可大大缩短生产时间，制备得的β-1,3葡聚糖可用于食品添加、医药保健以及化妆品行业，还可用于动物免疫，大大提高其附加值；对于酵母的综合利用有重要的意义。 

3.专利号200810238547.X，公开了一种利用酵母制备可溶性β-1,3-葡聚寡糖的方法，该方法包括碱预处理、酸水解和分离纯化，其中所述的分离纯化是将酸水解中制得的可溶性β-1,3- 葡聚寡糖溶解后，经过由AG50W-X4层析柱与Bio-Gel P4层析柱串联而成的分子筛层析系统进行分离纯化。该发明提供的β-1,3-葡聚寡糖制备方法操作较简单，所得寡糖种类较多，制备量大，可以重复操作，适用于工业化大规模生产。 

然而，上述三个专利所利用的啤酒酵母，其细胞壁β-1,3葡聚糖含量低，只占干啤酒酵母细胞重量的3%-5%，在提取过程中，必需加入大量的强酸、强碱，而且强酸强碱法提取得率低，其生产结果，不但成本高，而且给环境带来污染，是不符合当代绿色环保的要求。 

专利号94108278.4，公开了一种生产β-1,3-葡聚糖的方法，包括一种属于土壤杆菌、能生产β-1,3-葡聚糖并且是磷酸烯醇丙酮酸羧酸酶活性不足或缺乏的微生物和一种生产β-1,3-葡聚糖的方法，即在培养基中培养所述微生物，然后将其回收。该发明的方法可以以高产率（以碳水化合物计）和高效率生产β-1,3-葡聚糖。该方法的不足之处在于：工艺流程长，设备繁多，投资大，且有大量废水排放，产品售价昂贵，不适宜养殖户使用。 

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种生产效率高，碳水化合物转化率高，成本低，工艺流程短、无发酵液污水排放且环保的微生物发酵制备β-1,3葡聚糖作为鱼虾抗病因子饲料添加剂的方法。 

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种放射形土壤杆菌突变株，其分类命名为放射形土壤杆菌突变株L-15，学名为Agrobacterium radiobacter(Beijerinck et van Deiden)Cohn mutant strainL-15，保藏编号为cctccM NO：2012294，保藏日期为2012年7月19日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。