[发明专利]快速检测地沟油的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，包括：

(1)DNA提取缓冲液

所述DNA提取缓冲液的组成为：15～25mg/L CTAB、90～110nmol/L Tris-HCl、15～25mmol/L EDTA₂Na、1.3～1.5mol/L NaCl、0.09～0.12g/L蛋白酶K；

(2)Taq DNA聚合酶，所述Taq DNA聚合酶的浓度为125IU；

(3)PCR反应液

所述PCR反应液的组成为：2.7～3.3mmol/L MgCl₂，0.3～0.5μmol/L引物，0.3～0.5mmol/L dNTPs；

所述引物为针对动物内源性基因序列的通用引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，以及针对植物内源性基因序列的通用引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(4)上样缓冲液

所述上样缓冲液的组成为：2.0～3.0g/L溴酚蓝、350～450g/L蔗糖。

2.根据权利要求1所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对牛、羊、猪或鸡的线粒体基因序列的引物。

3.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对牛线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

4.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对羊线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

5.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对猪线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

6.根据权利要求2所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述针对鸡线粒体基因序列的引物为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。

7.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测地沟油的试剂盒，其特征在于，所述引物还包括针对玉米的内源基因序列的引物SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、针对大豆的内源基因序列的引物SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、针对大米的内源基因序列的引物SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18、针对花生的内源基因序列的引物SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20或针对油菜籽的内源基因序列的引物SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22。

8.一种快速检测地沟油的方法，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的试剂盒，包括以下步骤：

(1)制备样品DNA

取20～50mL油样与等体积双蒸水，振荡离心，弃去上层油脂，再加入20～50mL油样，继续振荡离心，重复7～8次，。待下层水相浑浊后，高速离心，弃去上层油脂，得到300～400mL油样，将水相浓缩干燥3～5小时后，加入2～3mL的DNA提取缓冲液，混匀后，置于65℃放置45～60min，不时摇动，用体积比为24∶1的氯仿∶异戊醇混合液进行提取，离心，取上清，加入异丙醇，-20℃放置2～3小时，高速离心，获得DNA沉淀，再用70％的乙醇溶液洗沉淀物，沉淀物加水溶解，即得样品DNA；

(2)PCR扩增反应

取PCR反应液、Taq DNA聚合酶置于反应管中，混匀，加入样品DNA，离心后置于扩增仪上进行扩增，反应参数：95℃预变性5min后，按94℃30sec，57℃45sec，72℃60sec程序进行40个循环，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。

(3)产物检测

反应产物，加上样缓冲液，充分混匀后点样，用DNA Marker作为分子量标准，用含溴化己锭染色的1.5％琼脂糖凝胶电泳，结束后，置紫外灯下观察，出现目标特异性条带的为含有某物种基因成分，否则为不含该物种基因成分。