[发明专利]一种海带配子体克隆培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及海带配子体克隆的培育方法，尤其涉及海带配子体克隆的无菌培育方法。

背景技术

海带，学名Laminaria japonica Aresch，褐藻的一种，生长在海底的岩石上，形状像带子，含有大量的碘质，属于褐藻门，褐子纲，海带目，海带科，海带属。藻体褐色，长带状，革质，一般长2～6米，宽20～30厘米。藻体明显区分为固着器、柄部和叶片。固着器假根状，柄部粗短圆柱形，柄上部为宽大长带状的叶片。海带具有极高的养殖价值，然而优良养殖品种的选育过程复杂、漫长。海带配子体在单独分离培养时可进行营养生长形成无性繁殖系(克隆)，其遗传性纯一，可长期保存，具有发育全能性并可杂交。海带配子体克隆作为海带种质资源保存和利用的主要材料，在育种、育苗研究中发挥着重要作用。利用海带雌雄配子体克隆配对杂交技术可以有效缩短选育周期，获得性状优良的杂交海带。这一技术在近些年的海带育种工作中得到有效运用。目前常规采用的海带配子体克隆培育方法，是通过简单擦洗(用120℃烘干消毒的脱脂棉沾取制冷至10℃的煮沸消毒海水擦洗种海带，去除表面的杂藻等附着物)种海带后进行游孢子放散、附着，待游孢子发育成配子体后用微吸管分离获得单个雌、雄配子体，在一定条件下将雌雄单独个体分离成功的海带配子体克隆培养在含营养盐的培养液中，放置于温度8～10℃、持续光照、光照强度800～1200lux的光照培养箱中培养，在此条件下，海带配子体可进行营养生长，形成无性繁殖系，培养使配子体进行无性繁殖形成单克隆系，所有操作在常规室内进行。但该方法由于种海带和环境空气消毒不彻底，极易发生细菌、真菌及杂藻污染，从而影响了配子体生长和成活率，不利于长期保存，又极大地增加了污染处理的工作量，最终导致种质资源损失。而且该方法体系稳定性较差，难以进行长期保存。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种可以长期保存，且可以保持稳定生长状态的海带配子体克隆培育方法。

本发明的技术解决方案是：

一种海带配子体克隆培育方法，其步骤是：

(1)剪取种海带块：剪取带有成熟孢子囊的种海带块；

(2)种海带块的预处理：用灭菌脱脂棉蘸取经制冷至10℃的煮沸消毒海水，对带有成熟孢子囊的种海带块进行充分擦洗；

(3)种海带块的消毒：在无菌室超净工作台内，预处理过的种海带块首先用无菌双抗海水浸泡30分钟，然后用1.5％浓度的碘化钾无菌海水溶液浸泡10分钟，最后用无菌海水浸泡20分钟；

(4)游孢子的放散、过滤：在无菌室超净工作台内，用无菌镊子夹取消毒后的种海带块，快速移入装有无菌海水的血清瓶中进行游孢子放散，放散后的无菌海水成为含有游孢子的孢子水，孢子水经筛绢过滤，滤出粘液及杂质；

(5)游孢子的附着和培养：在无菌室超净工作台内，过滤后的孢子水倒入装有载玻片的立式染色缸中，当游孢子附着于载玻片上形成胚孢子后，倒掉孢子水，加入无菌双抗海水，使载玻片完全浸泡在无菌双抗海水中，然后用酒精灯烤干立式染色缸的缸口后，盖上染色缸盖，在立式染色缸口外侧用封口膜拉伸封口进行培养即可得到发育成雌、雄可辨的配子体，再用微吸管将单个雌雄配子体分别分离至两个不同的血清瓶中，每个血清瓶分别用无菌双抗海水进行培养，即可得到单细胞的海带配子体克隆团。

上述步骤(4)中，所述筛绢为400目的经过高温高压灭菌的筛绢。

上述步骤(5)中，所述无菌双抗海水中含有有效氮、有效磷、青霉素和链霉素，有效氮浓度为10ppm，有效磷浓度为1ppm，青霉素浓度为120ppm，链霉素浓度为100ppm。所述培养条件是温度8～10℃、持续光照、光照强度800～1200lux。

上述无菌海水、1.5％浓度的碘化钾无菌海水和无菌双抗海水均在无菌室超净工作台内，经0.22um滤膜抽滤。

本发明的技术效果是：本发明对种海带和培养环境进行全面消毒，除预处理外所有操作均在无菌条件下进行，以无菌双抗海水作为培养液，在培养箱中持续光照培养，可有效避免污染，而且海带配子体生长和发育状态正常，使用本发明方法培育获得的海带配子体克隆性状稳定，生长正常，成活率高，能有效避免污染，适于长期保存，可大大减少工作量，降低培育成本，根本上解决现有方法中的污染问题。应用本发明方法，不仅可以使海带配子体克隆在无菌的条件下长期保存，且可以保持稳定的生长状态。

附图说明

1、图1为本发明微吸管分离后培育10天放大100倍的海带配子体克隆照片。

2、图2为本发明微吸管分离后培养45天的海带配子体克隆(直径0.5～1mm)照片。