[发明专利]利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是最早发现和最典型的神经营养因子，同时也是神经系统中最重要的生物活性分子之一。它由α、β、γ三个亚基组成，其中β亚基(β-NGF)是唯一具有生物学活性的亚基，它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。目前β-NGF已被开发成治疗外周神经损伤的药物应用于临床，广泛应用于神经损伤、偏瘫、卒中、颅脑损伤、小儿脑瘫等神经性疾病领域。但商品化的NGF为鼠源性的神经生长因子(mNGF)。这类动物源性的蛋白制品常常具有较高的免疫原性，容易引起人体内的抗原反应，严重者甚至会危及生命。而天然的人神经生长因子(hNGF)分布于人体的脑、神经节、虹膜、心脏、脾、胎盘等组织，原料有限，且其中hNGF含量低，分离纯化极其困难，无法直接提取获得。利用基因工程技术制备重组人神经生长因子是解决上述问题的一个主要途径。

在各大表达系统中，大肠杆菌表达系统因其表达水平高、生产成本低、便于工业化生产等优势成为制备重组人神经生长因子的首选。可是，部分真核基因在大肠杆菌表达系统中表达量极低，甚至不表达，原因在于真核生物和原核生物所偏好的密码子不一样。此外，大肠杆菌缺少真核生物蛋白质合成后的加工修饰系统，因此，表达的蛋白常常无生物学活性。研究者们发现，人β-NGF在大肠杆菌中的表达量不高，而且生物活性极低，经分析主要是由于β-NGF基因及其蛋白特殊的结构导致其难于在大肠杆菌系统中有效表达。

一方面β-NGF基因中使用了较多的大肠杆菌稀有密码子，导致β-NGF基因在大肠杆菌中表达量不高。

另一方面β-NGF蛋白结构特殊，难于在缺乏翻译后加工修饰系统的大肠杆菌中形成正确的结构，致使表达出的β-NGF蛋白生物活性极低，甚至没有活性。天然的β-NGF是由两条118个氨基酸组成的单链通过非共价键结合而成的二聚体，其中每条单链内含有由6个半胱氨酸相互配对形成的3对二硫键，这3对二硫键构成神经营养因子家族典型的结构模式——“胱氨酸结”模式(the cystine knot)，即两个二硫键桥(Cys58-Cys108和Cys68-Cys110)形成一个含有14个残基的环(loop)，Cys15和Cys80穿过这个环形成第三个二硫键桥。这种特殊结构模式在神经营养因子家族中高度保守，对维持β-NGF的正常生物学功能至关重要。大肠杆菌表达系统表达的β-NGF往往由于上述6个半胱氨酸不能正确配对，形成上述“胱氨酸结”结构，即不能形成正确的蛋白结构导致其生物活性极低。

针对上述问题，通用的做法是对需表达的基因进行密码子优化，同时构建分子伴侣与目标蛋白的融合蛋白，通过分子伴侣帮助目标蛋白体外折叠成为正确的结构。

针对基因进行密码子优化，需考虑大肠杆菌密码子偏好性，还应考虑基因序列及其转录的mRNA序列结构、稳定性以及核糖体结合序列的结合效率等因素，是一项复杂、技术难度较高的工作。