[发明专利]利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法

权利要求书

1.一种重组人神经生长因子β亚基基因，其含有6组氨酸纯化位点、肠激酶切割位点以及经过修饰的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因和分子伴侣基因，其中所述人神经生长因子β亚基成熟肽段基因为经过原核生物高频密码子改造后的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述分子伴侣基因为经过修饰的人神经生长因子β亚基前导肽基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种利用大肠杆菌表达系统制备重组人神经生长因子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用化学合成法合成经点突变优化的权利要求1所述的人神经生长因子β亚基成熟肽段基因及分子伴侣基因，并将其克隆入pET28 a (+)表达载体，得到重组表达载体；

(2)将步骤(1)所得重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株BL21(λDE3)中，构建含有重组表达载体的基因工程菌；

(3)培养步骤(2)所得基因工程菌至A550=0.6时，加入诱导剂IPTG，诱导重组人神经生长因子rhβNGF在该基因工程菌中表达；

(4)离心收集菌体，重悬菌体，-80℃冻存；

(5)解冻菌体重悬液，破碎菌体，分离纯化包涵体蛋白；

(6)体外复性包涵体蛋白，透析后超滤浓缩；

(7)经肠激酶切割去除分子伴侣；

(8)纯化获得所述重组人神经生长因子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(3)中诱导的时间为3-4小时。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(3)中诱导剂IPTG的浓度为1mmol/L。

5.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(4)中所用的重悬液为20mM Tris-HCl (pH8.0)，使用量为菌体湿重的20倍体积。

6.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(5)中破碎菌体的方法为超声破碎法，其中超声破碎菌体所用功率为400W，超声15秒，间隔15秒，作用30分钟。

7.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(6)中复性包涵体蛋白的方法为体外稀释复性法，其中体外稀释复性液中，精氨酸的浓度范围是0.75-1.0mmol/L，pH值是8.0-9.5。

8.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(7)中的肠激酶为带6组氨酸纯化位点的重组牛肠激酶。

9.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤(8)中纯化的方法为镍柱亲和层析法。