[发明专利]一种真菌发酵生产恩镰孢菌素类化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体公开了一种固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的工艺。

背景技术

恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)是一类非典型的环肽化合物，结构颇为奇特，分子有3个D-2-羟基异戊酸(HylV)和3个N-甲基氨基酸交替地连接构成十八元环肽骨架，已报道的这类化合物大都是在Fasarium属真菌中找到，迄今为止人们发现了约10个这类化合物(其中EnniatinA，A1，B1，B比较常见，其它还有Enniatin B2、B3、B4、E、F、G等)。[参见：Tetrahedron 59(2003)：1015-1020]

恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)具有以下通式：

EnniatinA，A1，B1，B四种化合物中R1、R2、R3的取代基分别为：

Enniatins类化合物有很好的抗菌、杀虫、植物毒素活性和胆固醇酰基转移酶(ACAT)抑制作用，近几年这一类化合物的抗HIV和选择性抗肿瘤活性都得到了很多的关注。[参见：Toxicon 56(2010)：418-424]

关于enniatins类抗生素的作用机制，目前认为enniatins是一类离子传导剂，能形成一价离子的“Sandiwich”络合物，穿过细胞膜，尤其是线粒体膜，阻断呼吸链上的氧化磷酸化反应。P.Zavge等认为十八元环状的骨架与一价离子的络合物的亲和力是其支链骨架的100倍。它们的抗菌活性则是来源于这类物质对一价钾离子或钠离子的高度选择性络合。

1992年Tomoda等发现enniains有抑制脂酰辅酶A：胆固醇脂酰转移酶(Acyl-CoA：cholesterolacyltransferase ACAT)的活性，IC₅₀＝22～110μM。ACAT在生物体内催化胆固醇3位羟基，由长链脂酰CoA将酰基导入生成胆固醇酯，在胆固醇代谢过程中起着重要作用；因此ACAT被认为是降低胆固醇和防治动脉硬化药物的靶酶。1997年，MaKee等发现enniatins有抗HIV病毒的作用，体外试验显示enniains B，B1和A1混合物的anti-HIVEC₅₀＝0.01μg·mL^-1，IC₅₀＝1.9μg·mL^-1，其中enniain B的anti-HIV EC₅₀＝0.16μM，IC₅₀＝0.78μM。Enniain G是林永成等从海洋真菌Halosarpheia sp.培养液中分离到的一个新化合物，据初步的药理实验表明，新化合物enniain G具有抗肝癌Heps7402活性，ED₅₀＝12μg·mL^-1。Dometshuber R.等报道了enniains发挥p53依赖性抑制细胞生长，对人体的癌细胞和p53依赖的细胞毒活性[参见：Toxicon 56(2010)：418-424]。

目前国内外极少有关于enniatins生产的报道，仅有少量产品在实验室条件下获得，且主要是通过微生物菌种发酵产生，但是发酵水平普遍不高(0.1g/kg培养基)，而且没有提取纯化工艺方面的报道[参见：J Agric Food Chem 40(1992)：1976-1982]。因此提供一种新的制备enniatins的方法是非常必要的。

发明内容

本发明提供了一种利用镰孢菌属(Fusarium)真菌固体发酵生产恩镰孢菌素类化合物(Enniatins)的生产工艺。

本发明共涉及三方面的内容，即固体发酵培养、提取工艺和纯化工艺。

(1)固体发酵培养：

菌种：镰孢菌属产恩镰孢菌素类化合物的任何真菌；

培养基组成：0～5重量份的氨基酸或蛋白胨、100～2000重量份的水、1000重量份的豆类，PH值为4～8。

接种量：按质量百分比，将生长好的菌种按1％～20％的比例接种；

发酵培养条件：于16～32℃，光照培养或暗培养或明暗交替培养，培养周期为4～24天。

(2)提取工艺：采用1～30倍体积的有机溶剂提取，收集溶剂部分；回收溶剂后的干膏备用；将上述干膏溶散到体积比为20％～80％醇/水中，以0.5～20倍体积的正已烷萃取，收集正已烷部位，回收溶剂，干燥备用；