[发明专利]一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的表达纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的表达纯化方法，属于基因工程蛋白质技术领域。

背景技术

p10基因是家蚕核型多角体病毒的晚期高效表达基因，表达的P10蛋白为病毒复制的非必须蛋白，但该蛋白参与了多角体囊膜的形成，并对多角体的稳定起到了一定作用。

现有文献中并无相关P10蛋白的纯化方法。由于P10蛋白本身具有自聚集的特性，在NaCl存在的情况下会发生自然沉降，用合适的缓冲液搅拌一定时间后又能溶解。因此，可将此特性运用到其纯化中。如果此纯化方法成熟，可将P10蛋白与其它蛋白融合表达，进一步利用P10蛋白的这种性质，纯化所需蛋白。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的纯化表达方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-32a(+)-p10，诱导表达得到大量重组目的蛋白，然后将蛋白放于4℃，使其产生自然沉降，离心后将沉淀洗涤并溶解从而得到大量较纯的重组目的蛋白。

为达到上述目的，本发明提供一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的表达纯化方法，包括以下步骤：

(a)以家蚕多角体病毒基因组为模板进行p10基因的扩增；

(b)分别双酶切p10基因和载体，连接构建重组表达载体，转化表达菌，构建p10基因工程菌；

(c)培养p10基因工程菌，诱导表达重组目的蛋白；

(d)纯化所得重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(a) 具体包括：

(1)设计上游引物F1：5'-GAAGGTCGTATGTCAAAGCCTAACGTT-3' 

上游引物F2：5'-GGAGCTCATCGAAGGTCGTATGTCAA-3'

下游引物R：5'-TCAAGCTTTTAGGAGTCTGGAGGATCC-3'； 

(2)以家蚕多角体病毒基因组为模板，用所设计引物F1和R扩增特异性目的片段，PCR反应参数设计为：93℃预变性5min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10min，回收产物；

(3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到p10基因；

优选地，其中所述步骤(b) 具体包括：

p10基因和pET-32a(+)载体利用Sac I和Hind III进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a(+)-p10，并转化表达菌E.coliBL21，构建p10基因工程菌。

优选地，其中所述步骤(c) 具体包括：

在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220 rpm振荡培养p10基因工程菌至OD₆₀₀=0.5，加终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，得到重组目的蛋白。

优选地，其中所述步骤(d) 具体包括：

(a)通过设计引物，由PCR扩增方法从家蚕核型多角体病毒基因组中获得p10基因；

(b)构建重组表达载体pET-32a(+)-p10，诱导表达得到大量重组目的蛋白；

(1)将得到的重组目的蛋白上清通过0.45μm纤维素膜过滤，存放于4℃，8-10h使其产生自然沉降；3000-5000rpm离心10-15min，将上清去除，保留沉淀；

(2)将沉淀用pH8.0的20mM Tris-500mM NaCl缓冲液洗涤1次。用移液器轻轻吹打，将沉淀吹起，然后3000-5000rpm离心10-15min，将上清去除，保留沉淀；

(3)用pH9.0的20mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，用移液器反复吹打，然后冰上搅拌10-15min，12000-15000rpm，离心10-15min，保留上清，得到纯度较高的重组目的蛋白。