[发明专利]一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的表达纯化方法

权利要求书

1.一种家蚕核型多角体病毒P10蛋白的表达纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)以家蚕多角体病毒基因组为模板进行p10基因的扩增；

(b)分别双酶切p10基因和载体，连接构建重组表达载体，转化表达菌，构建p10基因工程菌；

(c)培养p10基因工程菌，诱导表达重组目的蛋白；

(d)纯化所得重组目的蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(a) 具体包括：

(1)设计上游引物F1：5'-GAAGGTCGTATGTCAAAGCCTAACGTT-3' 

上游引物F2：5'-GGAGCTCATCGAAGGTCGTATGTCAA-3'

下游引物R：5'-TCAAGCTTTTAGGAGTCTGGAGGATCC-3'； 

(2)以家蚕多角体病毒基因组为模板，用所设计引物F1和R扩增特异性目的片段，PCR反应参数设计为：93℃预变性5min，98℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；最后72℃延伸10min，回收产物；

(3)以步骤(2)的回收产物为模板，用所设计引物F2和R第2次扩增目的片段，具体程序同上，最后回收产物，得到p10基因；

如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(b) 具体包括：

p10基因和pET-32a(+)载体利用Sac I和Hind III进行双酶切，将酶切回收的产物用ligation high进行连接并转化E.coli TG1感受态细胞，挑取单菌落摇菌培养后提取重组表达载体pET-32a(+)-p10，并转化表达菌E.coli BL21感受态细胞，构建p10基因工程菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(c) 具体包括：

在含50 mg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，220 rpm振荡培养p10基因工程菌至OD₆₀₀=0.5，加终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导表达，得到重组目的蛋白。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(d) 具体包括：

(1)将得到的重组目的蛋白上清通过0.45μm纤维素膜过滤，存放于4℃，8-10h使其产生自然沉降；3000-5000rpm离心10-15min，将上清去除，保留沉淀；

(2)将沉淀用pH8.0的20mM Tris-500mM NaCl缓冲液洗涤1次，用移液器轻轻吹打，将沉淀吹起，然后3000-5000rpm离心10-15min，将上清去除，保留沉淀；

(3)用pH9.0的20mM Tris-HCl缓冲液溶解沉淀，用移液器反复吹打，然后冰上搅拌10-15min，12000-15000rpm，离心10-15min，保留上清，得到纯度较高的重组目的蛋白。