[发明专利]一种大豆改良胚尖转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用农杆菌介导的大豆改良胚尖转化方法。 

背景技术

大豆「Glycine  max (L.)Merr.」原产我国，是重要的经济作物之一，其营养价值极高，蛋白质含量可达40％，而且品质好，易溶于水，最易被人体吸收利用，属全价蛋白，是唯一能代替动物性食品的植物产品。但是大豆产量和品质却容易受到病、虫、草害的影响。人们试图基因工程手段改良大豆，使其抗逆能力增强。但是用于转基因大豆的再生系统一直是此领域的难点之一。人们对大豆组织培养再生体系的研究可以追朔到20世纪60年代，到80年代才有突破性进展。其再生体系一般可分为两种，一种是器官发生途径，另一途径是体细胞胚的发生。到目前为止，大豆再生体系仍普遍存在再生率低、重复性差、基因型依赖强、培养条件烦琐等问题，在很大程度上限制了利用基因工程手段对大豆的遗传改良。因此，建立高效、简便的再生体系，对大豆生物技术育种取得突破性进展具有重要意义。 

在大豆植物组织培养研究与再生体系的研究中，先后有人选用胚轴、子叶节、胚尖、幼嫩子叶、原生质、花粉等不同的外植体进行了大豆再生研究，它们均有各自的优缺点。胚轴、子叶节、胚尖再生系统用时短，再生频率高，操作简单，不过易形成嵌合体，后期的检测、鉴定、筛选工作量大。幼嫩子叶、原生质、花粉再生体系，用时长，再生频率低，转化困难。 

2004年Liu等首次报道了利用胚尖再生系统进行农杆菌介导的遗传转化，其再生效率高达87.7％，远高于子叶节再生体系的40.3％和下胚轴再生体系的56.4％。 

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆改良胚尖转化方法。利用农杆菌介导，真空渗透辅助外源基因导入，带一片子叶的胚尖转化方法。本方法中带一片子叶的胚尖经过6-BA预培养诱导后，利用农杆菌真空渗透辅助侵染，共培养后直接转到营养土中培养即可获得高频的再生植株，该方法取材方便，不需要经过组织培养阶段，无严格的灭菌要求，再生率高、操作简单、生长周期短，是良好的遗传转化受体系统。 

本发明提供一种大豆改良胚尖转化方法包括的步骤：大豆外植体的获得；农杆菌菌液制备；真空渗透辅助侵染与共培养；转化外植体再生；移栽、筛选；具体为 

（1）    大豆外植体的获得

    挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25-28℃黑暗环境中浸泡萌发12-15 h 。

取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶， 获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24 -28h。预培养基: MS + 30g/L 蔗糖 + 1 mg/L 6- BA + 7 g/L琼脂， pH 5. 8。 

（2）    农杆菌菌液制备 

    在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒 pSOY12 的农杆菌单菌落接种于 LB 液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)，28℃，200 r/min振荡培养过夜，然后以1：10-20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0左右，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 左右作为工程菌液备用。LB 培养基: 10 g/L胰蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物 + 10g/LNaCl， pH7. 0， 固体LB培养基另加15 g/L。   

（3）    真空渗透辅助侵染与共培养

将预培养 24 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中， 26-28℃黑暗环境下共培养3 d。16 h /8 h( L/D) 的光照条件下培养1-3d。共培养培养基: MS+ 30 g/L蔗糖 + 1 mg/L6- BA + 200 mol·L^－1 乙酰丁香酮， pH 5. 8，固体共培养培养基另加7 g/L琼脂。

（4）    转化外植体再生