[发明专利]一种大豆改良胚尖转化方法

权利要求书

1.一种大豆改良胚尖转化方法，其特征在于：包括如下的步骤： 

1）大豆外植体的获得

挑取种皮完整、无病斑且干燥的成熟大豆种子，用氯酸钠：浓盐酸=10：1在乐扣杯中制造氯气，灭菌4-6h，超净工作台中通风使氯气散尽后加适量无菌水，25-28℃黑暗环境中浸泡萌发12-15 h ；

取吸胀萌动的大豆种子，在无菌滤纸上吸取多余水分，剥去种皮，沿远种脐端将两片子叶分开，去掉一片子叶和原叶，保留完整胚和另一片子叶， 获得带一片子叶的胚尖外植体，将外植体胚尖向上竖直插入预培养基中预培养24-28 h；

2）农杆菌菌液制备

在超净工作台中，用无菌移液器从 LB 培养平板(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)上吸取含有质粒 pSOY12 的农杆菌单菌落接种于 LB 液体培养基中(含卡那霉素50 mg/L 壮观霉素100 mg/L 氯霉素25 mg/L)，28℃，200 r/min振荡培养过夜，然后以1：10-20进行2次活化，培养至 OD600 = 1. 0，将菌液置于灭菌的离心管中，4000r/min 25℃离心10min收集菌体，将菌体重悬于液体共培养基，调整OD600 = 0. 5 左右作为工程菌液备用；   

3）真空渗透辅助侵染与共培养

将预培养 24-28 h 已转绿的外植体从培养基中取出，加入预先制备好的工程菌液，抽真空并维持0.05MPa压力5-8分钟，25-28℃黑暗环境下150 r/min振荡侵染1-3 h ，弃去菌液，将外植体近轴面朝下置于固体共培养培养基中，26-28℃黑暗环境下共培养3 d；16 h /8 h( L/D) 的光照条件下培养1-3d； 

4）转化外植体再生

将外植体从培养基中取出， 用无菌水彻底冲洗干净后种植于穴盘中，营养土：蛭石：珍珠岩=2：2：1，光照培养箱中培养，待长出4-6 片叶片后移栽至温室中生长；

5）筛选，PCR检测

当小苗在土壤中长出4-7片新叶，用除草剂150mg/L草甘膦涂抹叶片，筛选出有抗性的植株。采用CTAB法提取筛选为阳性的植株的基因组DNA，进行目的基因的PCR检测，目的基因检测的上下游引物序列分别为：上游：GCTGGCCATCGACGAGTTC，下游：GGCCAGGAAGTTCGGGAAG；PCR反应体系为1μL基因组DNA，2.5μL 10×PCR buffer，2μL dNTPs ( 2.5μM )，1.25U LA Taq 酶，加水至25μL；PCR 反应程序：94℃：3 min：94℃ 30s，55℃30 s，72℃30s，30个循环；72℃10 min。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述预培养基配方为：MS + 30g/L 蔗糖 + 1 mg/L 6- BA + 7 g/L琼脂， pH 5. 8。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述的LB 培养基: 10 g/L胰蛋白胨 + 5 g/L酵母提取物 + 10g/LNaCl， pH7. 0， 固体LB培养基另加15 g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤 （3）所述的共培养培养基: MS+ 30 g/L蔗糖 + 1 mg/L6- BA + 200 mol·L^－1 乙酰丁香酮， pH 5. 8，固体共培养培养基另加7 g/L琼脂。