[发明专利]一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以革兰氏阴性菌外膜孔蛋白为靶点筛选药物的方法，尤其是涉及一种以大肠杆菌外膜孔蛋白ompW为靶点筛选药物的方法。

背景技术

当前，人们对病原细菌的控制主要是通过几种不同杀菌机制的抗生素药物来进行的，目前常用抗生素的杀菌作用机制主要有以下4种：（1）抑制细菌细胞壁的合成：抑制细胞壁的合成会导致细菌细胞破裂死亡，以这种方式作用的抗菌药物包括青霉素类和头孢菌素类。（2）干扰蛋白质的合成：干扰蛋白质的合成意味着细胞存活所必需的酶不能被合成。干扰蛋白质合成的抗生素包括福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素。（3）抑制核酸的转录和复制：抑制核酸的功能阻止了细胞分裂和/或所需酶的合成。以这种方式作用的抗生素包括萘啶酸和二氯基吖啶。（4）与细胞膜相互作用：一些抗菌素与细胞的细胞膜相互作用而影响膜的渗透性，这对细胞具有致命的作用。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌素。

由于抗生素的大规模应用和不合理的临床使用，而使得细菌产生耐药性，不仅导致药物失去抗菌作用，甚至致使“超级细菌”的出现，这使得感染性疾病治疗及疫情控制面临困境，已在全球范围成为严重的公共卫生危机。但因具新型抗菌机制的药物的研发日益困难，且针对已有抗菌机制开发的药物的生命周期大大缩短等原因，近年来罕有新型抗菌药物上市。因此，本领域非常有必要寻找与细菌介导的感染性疾病相关的新的药物作用靶点和开发新的药物或研制新型疫苗，为更有效地控制和治疗感染性疾病提供新的途径。

已知大多数感染性疾病及历史上大规模爆发的传染病都是由革兰氏阴性菌引起，研究认为这主要与其复杂的外膜有关。革兰氏阴性菌外膜主要由外膜孔蛋白、脂质及脂多糖等成分组成，其中外膜孔蛋白为主要成分，约占50%，主要由具β-桶状结构的孔蛋白（porin）和脂蛋白两类蛋白组成，外膜孔蛋白是革兰氏阴性菌特有的成分，直接与外环境接触，不仅在维持外膜结构、细胞表面识别、信号转导和物质转运（尤其是铁的运输）等生理功能方面起重要作用，而且更为重要的是，某些外膜孔蛋白还与病原菌的毒力有关，且研究认为病原菌的毒力与机体内铁的调控有关。铁是病原菌感染发病和机体的免疫防御这一相互作用过程中的关键调控因子，病原菌经长期进化已发展了多种机制从宿主体内夺取铁来增强其毒力和致病性，同时损伤机体的免疫防御能力，是病原菌感染以及致病的关键因素之一。

中国专利公开号CN1699573A，公开日2005年11月23日，公开了一种溶藻酸弧菌外膜孔蛋白W基因与制备方法及其应用，提供一种新的溶藻酸弧菌ompW蛋白质活性的多肽的核苷酸序列和溶藻酸弧菌ompW蛋白的氨基酸序列及其利用重组技术制备溶藻酸弧菌ompW基因的方法，提供溶藻酸弧菌和副溶血弧菌ompW蛋白和编码序列的应用，其步骤为将编码具有溶藻酸弧菌ompW蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成溶藻酸ompW蛋白表达载体，将表达载体转入宿主细胞，形成溶藻酸弧菌ompW蛋白的重组细胞，培养重组细胞，分离。不足之处是：用于筛选药物可靠性差、筛选药物效率低，不适用于作为靶点筛选细菌介导的感染性疾病的新药物。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的药物筛选方法可靠性差、效率低、不适用于作为靶点筛选细菌介导的感染性疾病的新药物的不足，提供了一种操作简单、筛选可靠性好、效率高的以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为新型靶点的筛选药物的方法，用于筛选细菌介导的感染性疾病的新药物。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

     一种以大肠杆菌外膜孔蛋白OmpW为靶点筛选药物的方法，所述方法包括下列步骤：

（1）基因的克隆及重组载体的构建；

（2）重组载体的转化、筛选诱导表达得外膜孔蛋白OmpW高表达菌；

（3）以高表达菌的外膜孔蛋白OmpW为靶点进行细胞水平的药物筛选，用50~80μg/ml的待筛选化合物作用于高表达菌，培养0.5-1h，采用Western-blot分析检测高表达菌外膜孔蛋白OmpW的表达量变化，OmpW的表达量降低，待筛选化合物具有药物作用，OmpW的表达量不变或增加，待筛选化合物不具有药物作用。