[发明专利]一种直接测定土壤植酸酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植酸酶活性测定，具体的说是一种直接测定土壤植酸酶活性的方法。

背景技术

植酸酶属于磷酸单酯水解酶，是一类特殊的酸性磷酸酶，可催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸盐。1968年，Shien等确定第一个被分离纯化的植酸酶来源于土曲霉，并且从68个土样中对2000个菌株进行研究发现，在所得的22株黑曲霉中有21株能产生植酸酶。从此以后，陆续从十几种微生物中分离得到植酸酶。植酸酶主要来源于微生物。微生物来源的植酸酶分解植酸盐的最终产物主要是单磷酸肌醇和无机正磷酸盐。植酸及其盐类广泛存在于植物组织和相应的粮食产品中，占其总量的l-3％，其中磷含量占植物总磷的60-90％，是磷和肌醇的主要储存形式。植酸酶是催化植酸水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，因此，植酸酶已在饲料和食品工业中广泛地得到应用。而对植酸酶活性的检测成为衡量饲料、食品、土壤等中的磷素可利用性的一项重要指标。目前在植酸酶活性的检测工作中，常使用紫外分光光度法对酶反应产物正磷酸盐进行检测，并根据植酸酶活性单位的定义，由磷标准曲线计算出待检植酸酶的活性。世界公认的测定方法中，被广泛认可和使用较多的方法是Gostbrocades和BASF公司1991年提出的植酸酶活性的测定方法，但此方法在操作上仍存在不简便，方法稳定性不够，测定结果误差相对较大等缺点。而目前对于土壤中的植酸酶活性的测定方法仍没有形成一套完整且效果较好的体系，更多的是将土壤制成悬浊液后取定量悬液进行培养测定，而此方法操作不简便，误差较大，不能够完全真实的反应土壤植酸酶活性特征。因此，建立一种对土壤植酸酶活性的直接测定方法，提高土壤植酸酶活性测定的效率和准确性，对于评价土壤磷素利用状况具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种直接测定土壤植酸酶活性的方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种直接测定土壤植酸酶活性的方法，将甲苯加入到待测定土壤中，而后进行底物培养在待测土壤中加入pH5.5的乙酸缓冲液、植酸钠；待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，显色后在415nm下测定显色液吸光度，即可获得土壤植酸酶。

所述待测定土壤过筛后称取1.00g加入0.2mL甲苯抑制土壤微生物活性。

所述底物培养是向经甲苯处理过的测定土壤中加入0.25mol L^-1pH5.5的乙酸缓冲液后，再加入2mL浓度0.00761mol L^-1的植酸钠溶液，轻摇混匀后放入恒温培养箱内在30-40℃恒温条件下密闭培养0.5-1.5小时。

所述待培养终止加入显色液终止酶促反应并显色，是将底物培养后待测定土壤中加入2mL的显色液，摇匀显色20–30min后过滤，取上清液在415nm下测定吸光度。

所述显色液为钼酸铵溶液（100g L^-1）、钒酸铵溶液（2.35g L^-1）和稀硝酸（浓硝酸:水=1:2的混合液，所述钼酸铵溶液、钒酸铵溶液和稀硝酸按体积比为1:1:2的混合。

本发明具有以下优点：

1.本发明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，控制了土壤微生物在对植酸酶活性测定过程中的影响。

2.本发明直接将土壤进行培养，调节植酸酶最适pH以及最适温度，使土壤中的植酸酶活性得到最真实的表达。

3.本发明采用终止/显色液，既是酶促反应终止液，又是产物反应液，同时颜色反应不受温度和时间限制，操作稳定可靠。

附图说明

图1为本发明实施例提供的不同土壤植酸酶活性特征图。

具体实施方式

本发明采用甲苯抑制土壤中的微生物活性，从而控制微生物活动对酶活测定的影响；然后，在土壤中加入pH5.5的乙酸缓冲液，再加入底物植酸钠进行培养；培养后加入终止/显色液，终止反应并显色，在415nm下测定吸光度即可获得土壤植酸酶活性。具体方法详述如下：