[发明专利]一种水中两虫的富集、纯化方法及其含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种水中检测技术领域的方法，具体是一种浊水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法及其在浊水中含量的检测方法。 

背景技术

隐孢子虫和贾第鞭毛虫(即“两虫”)是两种寄生于人和动物体内的致病性原生动物，近年来国外出现了多次由于水中“两虫”所导致的介水疾病的暴发，其危害已经引起了广泛的重视。我国修订的《生活饮用水卫生标准》(GB5947-2006)中，在微生物指标部分增加了对隐孢子虫和贾第鞭毛虫的检测，明确规定其限值＜1个/10L。 

通过对现有技术的检索发现，对于水中“两虫”的检测都是通过水样过滤浓缩，分离纯化，染色及镜检这几个主要步骤来完成实现的，其中最为常用的检测方法是采用美国的EPA 1623方法(“EPA1623方法”是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的标准方法)。我国饮用水卫生标准检测方法中也参考采用了该方法。该方法采用滤筒/滤囊过滤，免疫磁珠分离(IMS)和免疫荧光染色显微观察，利用微分干涉来检测和计数隐孢子虫和贾第鞭毛虫，通过显微镜观察确认，该方法实验条件要求较高，同时检测成本昂贵，如需用专用的滤囊/滤芯以及免疫磁珠分离试剂盒等。日本对检测环境水样中的“两虫”方法进行了改进，用膜过滤-丙酮溶解这一操作步骤优替代1623中的滤筒/滤囊过滤，避免了洗脱过程中“两虫”的流失，提高了回收率。然而当水源水中浊度较高条件下，无论采用滤囊/滤芯或膜过滤的方式进行浓缩，往往需要多个滤囊/滤芯或滤膜进行，不仅操作上麻烦，而且实验耗费较大；同时由于得到过多的沉淀，不利于隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的进一步分离纯化，导致回收率不高。因此有必要针对混浊水条件下开发一种操作方便，且成本不高的富集及分离纯化方法，浊水中隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法及其在浊水中含量的检测方法。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题和不足，提供一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集、分离纯化及其含量的检测方法，本发明方法中“两虫”的回收率高，背景杂质干扰少，测定结果准确，同时本发明不需要昂贵的仪器设备、耗材，操作简便，达到了降低测试成本的目的。 

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集和分离纯化方法，包括如下顺序进行的步骤： 

(1)沉降、富集处理 

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后调节水的pH值，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(2)酸解离处理 

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀； 

(3)纯化处理 

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。 

其中，步骤(1)中所述水样的浊度≥20NTU，所述水的浊度优选为20-100NTU，进一步优选为20-60NTU；向水中加入等摩尔量的氯化钙和碳酸氢钠；调节水的pH值为9.50-10.50，优选为10.00±0.05。 

特别是，每10L水中添加0.1-0.2mol的所述氯化钙；沉降时间为12-24h。 

尤其是，所述氯化钙选用氯化钙溶液；所述碳酸氢钠选用碳酸氢钠溶液。 

其中，采用向水样中加入氢氧化钠进行所述水样的pH调节。 

特别是，采用浓度为1-10mol/L的氢氧化钠溶液条件水样的pH值，氢氧化钠溶液的浓度优选为10mol/L。 

特别是，所述氯化钙溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；所述碳酸氢钠溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L。 

特别是，还包括沉降后去除上清液，得到浓缩富集的隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀。

其中，步骤(2)中所述酸性物质的物质的量为0.2-0.4mol，即酸性物质的摩尔数 为0.2-0.4mol。 

特别是，所述酸性物质选择氨基磺酸溶液、盐酸溶液或醋酸溶液，优选为氨基磺酸溶液。 

尤其是，所述氨基磺酸溶液的浓度为1-10mol/L，优选为1mol/L；每10L水中添加0.2-0.4mol所述氨基磺酸。 

特别是，在2000g，4℃下进行所述离心处理10min。