[发明专利]一种水中两虫的富集、纯化方法及其含量的测定方法

权利要求书

1.一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的富集和纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)沉降、富集处理

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后调节水样的pH，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

2)酸解离处理

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(3)纯化处理

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中所述水样的浊度≥20NTU。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中每10L水样中加入0.1-0.2mol的氯化钙。

4.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(1)中调节水的pH值为9.50-10.50。

5.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(2)中每10L水样中加入0.2-0.4mol的酸性物质。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液按照如下步骤制备而成：

A)按照如下用量备料(以1L水量计)

NaCl              8.0g

Na₂HPO₄·12H₂O    2.9g

KCl            0.2g

KH₂PO₄         0.2g

B)将上述原料加入到1000mL纯水中，搅拌溶解均匀后，调节pH到7.2-7.4，制得磷酸盐缓冲溶液；

C)向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80，搅拌混匀，即得，其中每100mL磷酸盐缓冲溶液中加入0.01-0.2mL的吐温80。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中加入的磷酸盐-吐温缓冲溶液的体积与所述酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀的体积之比为10-30∶1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中所述Percoll-蔗糖介质的密度为1.10-1.15g/cm³。

9.如权利要求1所述的方法，其特征是：步骤(3)中加入的Percoll-蔗糖介质与所述隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液的体积之比为1∶2。

10.一种水中隐孢子虫和贾第鞭毛虫的测定方法，包括如下顺序进行的步骤：

(1)沉降、富集处理

向水样中加入氯化钙和碳酸氢钠，然后加入氢氧化钠调节水的pH值至碱性，在碱性条件下隐孢子虫和贾第鞭毛虫随着生成的碳酸钙沉淀一起沉降，得到隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(2)酸解离处理

向隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入酸性物质，酸解离处理，碳酸钙沉淀溶解，得到酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀；

(3)纯化处理

向酸解离隐孢子虫和贾第鞭毛虫沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液，接着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层，取中间层，得隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液；

(4)染色、镜检

首先，对隐孢子虫和贾第鞭毛虫纯化液进行过滤处理，接着进行染色处理，然后置于显微镜下观察，镜检计数。