[发明专利]小菜蛾对Bt杀虫蛋白抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物领域，尤其涉及小菜蛾对Bt杀虫蛋白抗性的实时荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。

背景技术

小菜蛾Plutella xylostella(L.)，又名菜蛾，方块蛾，属鳞翅目(Lepidoptera)菜蛾科(Plutellidae)，是一种世界性危害的重要蔬菜害虫，寄主多达40种以上，现已成为世界范围内十字花科蔬菜生产的重大障碍。在我国，上世纪70年代以来，小菜蛾逐渐上升为长江中下游地区十字花科蔬菜的主要害虫，且其分布不断向北扩展(赵建周等，1994)，目前，在我国广大的华北、东北、西北地区该虫的危害也已日趋严重。小菜蛾主要以幼虫在十字花科蔬菜的整个生长期危害叶片，大大降低了蔬菜的产量和质量，个别田块严重发生时能减产90%以上，甚至绝产，每年都引起巨大的经济损失(Taleka and Shelton,1993)。小菜蛾之所以危害如此严重主要是因为它能很快对多种化学药剂产生抗药性，对农药具有超强的适应性。它几乎对用于防治其危害的各类杀虫剂都产生了不同程度的抗药性，这主要包括有机磷类、有机氯类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类、昆虫生长发育调节剂以及生物源农药阿维菌素、多杀菌素和苏云金芽孢杆菌Bt等五十多种杀虫剂(唐振华和周成理，1992)。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种在芽孢形成期间可产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs，又被称为δ-内毒素)的革兰氏阳性细菌。自上世纪30年代以来，Bt即作为生物杀虫剂被广泛用于田间害虫防治。由于其杀虫谱广，专一性强，对人畜无害，对环境友好等优点，Bt制剂现已成为世界上应用最广的一类微生物杀虫剂。而且，目前编码Bt杀虫蛋白的多种基因也已被成功转入到了多种重要的粮棉作物中，用于田间害虫防治。多年来，它在害虫防治中发挥了重要作用。但是Bt制剂大量及不合理的使用最终造成了害虫产生Bt抗性。在实验室内，许多害虫已经汰选出了Bt抗性，更为可怕的是，目前在世界范围内至少已有8种害虫被报道已经在田间产生Bt抗性，这其中包括2种害虫对Bt制剂产生抗性以及6种害虫对Bt作物产生抗性(Tabashnik et al.,2011)，其中，小菜蛾是最早报道的对Bt喷洒制剂形成抗性的田间害虫种群(Tabashnik et al.,1990)，目前，在国外，如美国、日本、马来西亚、墨西哥和印度等多个国家发现小菜蛾已对Bt产生了较高的抗性(Morishita et al.,1992；Tang et al.,1996；Wright et al.,1997；Pérez and Shelton,1997；Díaz Gómez et al.,2000；Mohan and Gujar,2003)。而在我国，在广东、福建、浙江及江苏等省的菜区的田间小菜蛾种群也已对Bt产生了不同程度的抗性(冯夏等，1996；李建洪等，1998；周程爱等，2000；余德亿等，2000；郭世俭等，2003；王崇利等，2006；Zhou et al.，2011)。由此可见，小菜蛾Bt抗性问题已日趋严重。

由此可知，小菜蛾的Bt抗性问题已非常突出，因此为了更有效的使用Bt生物农药防治小菜蛾，开发有效地小菜蛾Bt抗性早期快速分子诊断技术就显得尤为重要。目前，尽管一些基于PCR方法的分子标记技术如RAPD(Random Amplifide Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)、AFLP(Amplifide Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)已经用于小菜蛾抗性相关基因的寻找上，但这些标记并未直接用于小菜蛾抗性检测，小菜蛾Bt抗性检测仍局限于生物测定方法。然而，传统的生物测定方法有一些缺点：(1)灵敏度低：生物测定很难检测早期抗性或低频率抗性；(2)周期长：小菜蛾的Bt生物测定结果一般需要2天(48小时)以上；(3)对试虫数量要求很大：测定一个标准曲线完成一次生测至少需要约200头试虫，且对昆虫饲养的要求也很高。(4)操作麻烦且标准性不强：方法比较繁琐，操作起来比较复杂，从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫的大小一致，不仅导致生测的工作量加大，而且诸多人为因素也会影响生测结果；(6)传统的方法从软件绘出的标准曲线求出的LC₅₀和LC₉₀值的重复性和精确性较低；(7)传统的生物测定方法对供试昆虫测得的抗性水平往往具有滞后性。